線粒體功能障礙和能量代謝異常是癌癥的主要特征。然而，癌癥進展過程中線粒體功能障礙的機制遠未闡明。本文證明，琥珀酰輔酶A（CoA）合成酶GDP形成亞基β（SUCLG2）的表達水平會影響肺腺癌（LUAD）細胞的整體琥珀酰化。琥珀酰化組分析表明，缺失SUCLG2可上調線粒體蛋白的琥珀酰化水平，并通過降低酶活性或蛋白穩定性來抑制關鍵代謝酶的功能，從而抑制LUAD細胞的線粒體功能。有趣的是，SUCLG2本身也會在Lys93上發生琥珀酰化，這種琥珀酰化會增強其蛋白質的穩定性，從而導致SUCLG2的上調，促進LUAD細胞的增殖和腫瘤發生。Sirtuin 5（SIRT5）對SUCLG2的Lys93進行脫琥珀酰化，然后由含三方基序蛋白21（TRIM21）通過K63連接介導泛素化，并在溶酶體中降解。研究結果揭示了SUCLG2在線粒體功能障礙中的新作用，闡明了SUCLG2在LUAD中琥珀酰化介導的蛋白質平衡機制，從而為開發針對SUCLG2的抗癌藥物提供了理論依據。本文于2023年10月發表于《Advanced Science》，IF=15.1。

技術路線

實驗結果

1. SUCLG2是LUAD細胞增殖的必要條件，與LUAD患者的不良生存率密切相關

        GDP特異性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLG2）和ATP特異性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLA2）是琥珀酰-CoA合成酶的兩個不同的β亞基。為了研究SUCL在LUAD 中的作用，作者首先檢測了SUCLG2和SUCLA2在LUAD細胞和組織中的蛋白表達,作者發現，與人類支氣管上皮細胞系BEAS-2B相比，SUCLG2在所有LUAD細胞中的蛋白表達均顯著上調。與BEAS-2B相比，SUCLA2在一些LUAD細胞中上調，但在另一些細胞中則下調，而且未發現一致的趨勢（圖1A）。當作者檢測LUAD組織中SUCLG2和SUCLA2的表達時，也得到了類似的結果。圖1B顯示，SUCLG2在LUAD組織中的表達高于鄰近的正常組織，而SUCLA2在大多數組織對中無明顯變化。為了研究SUCLG2和SUCLA2在LUAD細胞增殖中的功能，作者使用CRISPR-Cas9技術刪除了A549和H1299細胞中的SUCLG2或SUCLA2。然后，作者進行了細胞增殖實驗，當SUCLG2而非SUCLA2被敲除時，LUAD細胞的增殖率明顯下降（圖1C,D）。因此，這些結果表明，SUCLG2 而不是SUCLA2在LUAD中起著重要作用。

        作者還進行了異種移植試驗，以確定A549野生型（WT）和SUCLG2基因敲除（SUCLG2-KO）細胞的腫瘤發生情況。與A549-WT細胞相比，A549 SUCLG2-KO的腫瘤重量和體積均有所下降（圖1E-G）。為了證實這些結果，作者使用抗Ki67、抗TTF1和抗SUCLG2抗體對A549-WT和A549-SUCLG2-KO的腫瘤樣本進行了免疫組化（IHC）分析。Ki67在病理評估中被廣泛用作增殖標志物，而TTF1在高級別LUAD中經常被抑制。作者的結果顯示，A549-WT組的Ki67和SUCLG2染色明顯高于A549-SUCLG2-KO組。然而，A549-WT組的TTF1染色低于A549-SUCLG2-KO組（圖1H）。為了進一步確定SUCLG2在LUAD中的高表達是否具有臨床意義，作者使用抗SUCLG2抗體通過IHC檢測了SUCLG2在LUAD組織陣列中的蛋白表達。該組織陣列包括來自90名LUAD患者的肺癌組織和鄰近的正常組織。結果表明，與鄰近的正常組織相比，腫瘤組織表達的SUCLG2水平明顯更高（圖1I）；染色定量進一步驗證了這一結果（圖1J）。對癌癥組織染色定量結果的統計分析根據SUCLG2水平將樣本分為兩組。患者生存率與 SUCLG2 水平相關。如圖1K所示，SUCLG2水平低的患者比SUCLG2水平高的患者生存率更高（P = 0.0252）。這些結果表明，SUCLG2影響LUAD細胞的增殖和腫瘤發生，并與LUAD的進展和患者生存密切相關。

2. SUCLG2 缺乏導致線粒體功能障礙

        線粒體是新陳代謝活動的核心細胞器，而SUCLG2是TCA循環中的一個關鍵酶。因此，作者推測SUCLG2可能會通過調節線粒體代謝來影響腫瘤的增殖。作者對A549-WT和A549-SUCLG2-KO細胞進行了非靶向代謝組學研究，發現與A549-WT細胞相比，A549-SUCLG2-KO細胞中有15種代謝物上調，64種代謝物下調（圖2A）。作者利用KEGG通路分析對代謝物進行了分析，發現線粒體相關代謝通路如TCA循環和谷胱甘肽代謝發生了顯著變化（圖2B）。為了檢測SUCLG2對線粒體功能的影響，作者進行了透射電子顯微鏡（TEM）檢查，結果發現，A549細胞中的線粒體呈管狀，嵴清晰，而A549-SUCLG2-KO細胞中的線粒體腫脹，嵴斷裂（圖2C）。作者發現在A549和H1299細胞中敲除SUCLG2會降低mtDNA水平（圖2D）。此外，與對照細胞相比，SUCLG2-KO 細胞中的細胞ROS水平升高（圖2E）。敲除SUCLG2后，A549和H1299細胞中的ATP含量下降（圖2F）。隨后，作者測量了敲除SUCLG2 的A549和H1299細胞的線粒體膜電位（MMP）。與對照細胞相比，SUCLG2基因敲除細胞的線粒體膜電位明顯降低（圖2G）。從這些結果中，作者得出結論，LUAD細胞線粒體功能的維持依賴于SUCLG2的表達。

3. SUCLG2基因敲除誘導蛋白質琥珀酰化的全面增加

        SUCLG2是琥珀酰-CoA的主要水解酶，而琥珀酰-CoA是蛋白質琥珀酰化的主要琥珀酰修飾底物。琥珀酰化被認為是一種受琥珀酰-CoA供體濃度調節的非酶促反應。因此，作者推測SUCLG2可能通過琥珀酰化調節線粒體功能和代謝重編程。由于琥珀酰-CoA會被氧化水解，因此很難檢測到。因此，作者在敲除SUCLG2的A549和 H1299細胞中檢測了由SUCLG2催化的琥珀酰-CoA產物琥珀酸的含量。圖3A顯示，SUCLG2基因敲除明顯降低了琥珀酸的含量。接下來作者研究了SUCLG2對細胞內蛋白質琥珀酰化水平的影響。結果顯示，SUCLG2基因敲除增加了細胞內蛋白質的琥珀酰化水平（圖3B）。然后，作者進行了琥珀酰4D質譜分析，以進一步研究受SUCLG2調控的蛋白質的琥珀酰化情況。結果發現，在SUCLG2基因敲除的細胞中，285個蛋白質中有686個琥珀酰賴氨酸（K-su）位點，44個蛋白質中有61個不同表達的琥珀酰化位點。作者發現，與A549-WT細胞相比，在A549-SUCLG2-KO細胞中發現的大部分琥珀酰化上調，61%分布在線粒體中（圖3C）。GO分析表明，線粒體相關的代謝途徑，如能量產生和轉化，發生了顯著變化（圖3D）。與線粒體功能相關的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、NAD依賴性蘋果酸酶（ME2）、異檸檬酸脫氫酶（IDH2）、蘋果酸脫氫酶（MDH2）和酰輔酶 A 硫代酯酶9（ACOT9）等關鍵酶的琥珀酰化在特定位點顯著上調（圖3E-J）。這些結果表明，SUCLG2基因敲除促進了與線粒體功能相關的蛋白質的琥珀酰化。

4. SUCLG2通過調節琥珀酰化影響蛋白質的穩定性或酶活性

        接下來，作者研究了SUCLG2對GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9等關鍵酶功能的影響。作者首先檢測了SUCLG2對這些蛋白質琥珀酰化的影響，以驗證琥珀酰4D質譜分析結果。結果顯示，SUCLG2敲除會增加GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的琥珀酰化（圖4A-E），而在A549細胞中過表達SUCLG2會降低這些蛋白的琥珀酰化（圖4F-J）。這些結果證實，SUCLG2調控線粒體相關蛋白的琥珀酰化。接下來，作者研究了SUCLG2如何影響這些代謝酶的功能。首先，作者用Western印跡法檢測了SUCLG2敲除的A549和H1299細胞中GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的表達。圖4K顯示，SUCLG2基因敲除降低了ME2和ACOT9的蛋白表達，而GAPDH、IDH2和MDH2的表達未受影響。為了確定SUCLG2如何調控ME2和ACOT9的表達，作者測定了A549-WT和A549-SUCLG2-KO細胞中ME2和ACOT9的穩定性。結果顯示，與A549-WT細胞相比，ME2和ACOT9蛋白在A549-SUCLG2-KO細胞中的降解速度更快（圖4L）。為了進一步證實蛋白質的穩定性受琥珀酰化的調控，作者對ACOT9（K157R，K294R）和ME2（K26R，K94R）的琥珀酰化位點進行了點突變，這些突變位點是通過琥珀酰4D質譜分析結果確定的。由于GAPDH、IDH2和MDH2的表達不受SUCLG2敲除的影響，作者接下來檢測了這些酶的酶活性。敲除SUCLG2會降低A549和H1299細胞中GAPDH、ME2、IDH2 和MDH2的活性（圖4M-P）。這些結果表明，敲除SUCLG2會降低酶活性或蛋白質穩定性，從而抑制與線粒體功能相關的關鍵代謝酶的功能。

5. TRIM21通過K63-連接泛素化介導的溶酶體途徑誘導SUCLG2降解

        作者進行了環己亞胺（CHX）酶切實驗，檢測SUCLG2蛋白在LUAD細胞系（A549、HCC827和H1299）和BEAS-2B細胞中的穩定性。結果顯示，與A549、HCC827和H1299細胞相比，SUCLG2蛋白在BEAS-2B細胞中的降解速度明顯加快（圖5A）。這些結果表明，SUCLG2在LUAD中的高表達是由于蛋白質穩定性的增強。因此，作者研究了SUCLG2的降解途徑。作者發現，用CHX處理A549細胞24小時后，SUCLG2的蛋白水平明顯下降，加入溶酶體抑制劑氯喹（CQ）后可以恢復，但蛋白酶體抑制劑MG132不能恢復（圖5B）。此外，作者通過加入MG132或CQ檢測了SUCLG2的泛素化水平，發現加入CQ而不是MG132 時，SUCLG2的泛素化顯著增加（圖5C）。然后作者檢測了泛素化類型，發現在用CQ處理的A549細胞中，SUCLG2的K63-連接泛素化上調（圖5D）。這些結果表明，SUCLG2蛋白是通過K63鏈接泛素化介導的溶酶體途徑降解的。

        為了確定SUCLG2的E3連接酶，作者進行了質譜分析，發現TRIM21是一種推定的SUCLG2相互作用蛋白（圖5E）。作者利用免疫沉淀技術驗證了 SUCLG2 與 TRIM21在A549細胞中的相互作用（圖5F）。然后，作者檢測了過表達或敲除TRIM21時SUCLG2 的蛋白水平。結果顯示，過表達TRIM21會降低A549細胞中SUCLG2蛋白的表達（圖5G）。此外，過表達TRIM21會加快CHX處理后SUCLG2的降解速度（圖5H）。同時，作者發現在LUAD細胞和BEAS-2B細胞中，TRIM21和SUCLG2的蛋白表達呈負相關（圖5I）。在LUAD組織中也觀察到了類似的趨勢。TRIM21的蛋白表達與SUCLG2、SIRT5和SUCLG2呈負相關，未見一致趨勢（圖5J）。作者進一步探討了TRIM21介導的SUCLG2泛素鏈連接類型，過表達TRIM21增加了 SUCLG2的K63連接泛素化（圖5K）。總之，這些數據支持 TRIM21 通過 K63 連接泛素化 SUCLG2，然后通過溶酶體降解的模型。

        作者接下來確定了受TRIM21調控的SUCLG2泛素化位點。利用 PhosphoSitePlus，作者確定了K101、K118、K132、K200和K386為SUCLG2的推定泛素化位點（圖 5L）。然后，作者構建了含有指定突變（K101R、K118R、K132R、K200R和K386R）的SUCLG2質粒。作者發現，當TRIM21被過表達時，只有SUCLG2K200R的泛素化沒有發生變化（圖5M）。接下來，作者測量了野生型SUCLG2（SUCLG2WT）和 SUCLG2K200R 突變體的穩定性。在用CHX處理細胞時，SUCLG2K200R 的降解速度比 SUCLG2WT 慢得多。此外，TRIM21的過表達并不能提高SUCLG2K200R的降解率（圖5N）。這些數據表明，SUCLG2的K200是TRIM21的主要泛素化位點。

6. SUCLG2的K93-琥珀酰化影響TRIM21介導的SUCLG2降解

        SUCLG2定位于線粒體基質，是將琥珀酰-CoA轉化為琥珀酸的關鍵。因此，作者推測琥珀酰化會影響SUCLG2的功能。首先，作者利用共轉印證明了SUCLG2蛋白可被琥珀酰化（圖6A）。利用PhosphoSitePlus和質譜分析結果，作者確定K78、K93和K338為SUCLG2的假定琥珀酰化位點（圖6B）。為了確定SUCLG2的主要琥珀酰化位點，作者構建了含有所述突變（K78R、K93R 和 K338R）的SUCLG2質粒，發現與SUCLG2WT相比，只有SUCLG2K93R的琥珀酰化減少（圖6C）。接下來作者測量了SUCLG2WT和SUCLG2K93R的穩定性。用CHX處理細胞時，SUCLG2K93R蛋白水平的下降速度比SUCLG2WT快（圖6D）。這些結果表明，SUCLG2的K93是SUCLG2的主要琥珀酰化位點，其突變會降低蛋白在LUAD細胞中的穩定性。

        作者接下來探討了SUCLG2的琥珀酰化是否會調控其泛素化。作者進行了聯合泛素化檢測，發現與SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R的泛素化作用更強（圖6E）。這一結果表明，SUCLG2K93R突變體影響了SUCLG2的泛素化。作者還發現TRIM21更傾向于結合SUCLG2K93R并增加其泛素化（圖6F和G）。此外，與SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R結合了更多的p62（圖 6H）。這些結果證實，SUCLG2K93R通過增加 TRIM21介導的泛素化和溶酶體降解來促進其降解。

7. SIRT5 是SUCLG2的脫琥珀酰化酶并影響其蛋白穩定性

        脫琥珀酰化主要由依賴NAD+ 的SIRT家族調控。作者試圖確定哪種SIRT參與了SUCLG2的脫琥珀酰化。迄今為止，已有報道稱SIRT5和SIRT7是線粒體中的脫琥珀酰化酶。作者研究了SIRT5和SIRT7是否能使SUCLG2去琥珀酰化并影響其功能。在過表達SIRT5的細胞中，琥珀酰化的SUCLG2水平明顯低于含有空載體的細胞（圖7A）。圖7B顯示，敲除SIRT5增加了SUCLG2的琥珀酸化。接下來，作者通過共顯微鏡（co-IP）驗證了SUCLG2和SIRT5之間的相互作用。結果顯示，SUCLG2 和SIRT5相互作用（圖 7C、D）。為了進一步驗證它們之間的相互作用，作者進行了免疫熒光和線粒體分離試驗。結果顯示，SIRT5與SUCLG2在線粒體中共位（圖 7E和F），表明SIRT5與SUCLG2相互作用。

        作者接下來探討了SIRT5和SUCLG2之間的關系。首先，過表達或敲除SIRT5，并檢測SUCLG2的表達。敲除SIRT5導致SUCLG2蛋白水平升高，而過表達SIRT5 則降低了SUCLG2的表達（圖7G、H）。利用CHX阻斷SUCLG2的蛋白合成，作者發現過表達SIRT5會加速SUCLG2的降解（圖7I）。接著，作者發現過表達SIRT5 會顯著增加SUCLG2的泛素化水平（圖7J），而敲除SIRT5則會減少SUCLG2的泛素化（圖7K）。作者進一步檢測了SIRT5誘導的SUCLG2泛素鏈的類型。過表達 SIRT5增加了SUCLG2的K63連接泛素化（圖7L）。作者還利用共轉錄分析發現，在A549細胞中，過表達SIRT5可促進SUCLG2與TRIM21和p62的結合（圖7M,N）。這些結果表明，SIRT5通過K63連接泛素化SUCLG2，然后通過溶酶體途徑降解。

        接下來，作者探討了SIRT5與SUCLG2K93R 之間的關系。作者發現SIRT5并不影響SUCLG2K93R的琥珀酰化（圖7O）。綜上所述，這些結果表明SIRT5是SUCLG2 在Lys93上的脫琥珀酰化酶，促進了TRIM21介導的SUCLG2降解。

8. 抑制SUCLG2在K93上的琥珀酰化會導致LUAD細胞線粒體功能障礙并減少腫瘤發生

        為了進一步研究TRIM21是否通過調控SUCLG2的泛素化和降解來影響腫瘤的發生，作者在A549和H1299細胞中過表達了TRIM21和SUCLG2，細胞生長實驗顯示，過表達TRIM21抑制了A549和H1299細胞的生長。然而，SUCLG2的表達克服了過表達TRIM21對細胞增殖的抑制作用（圖8A,B）。同樣，SIRT5也會抑制A549和H1299細胞的生長，而SUCLG2會降低過表達SIRT5對細胞生長的抑制作用（圖8C和D）。這些結果表明，SUCLG2介導了SIRT5和TRIM21對LUAD細胞增殖的功能。為了給開發靶向SUCLG2的抗腫瘤藥物提供理論依據，作者去除了內源性SUCLG2，并將野生型SUCLG2（SUCLG2WT）或SUCLG2K93R突變體穩定地重新導入A549細胞（圖8E）。作者評估了SUCLG2K93R 突變體對線粒體功能的影響，并使用 TEM觀察線粒體的形態變化。A549-SUCLG2WT細胞中的線粒體嵴完整，形態特征正常。然而，A549-SUCLG2K93R細胞中的線粒體出現空泡化和腫脹，嵴斷裂（圖8F）。為了進一步確定線粒體質量的差異，作者檢測了A549-SUCLG2WT和A549-SUCLG2K93R細胞的mtDNA拷貝數。作者發現，與A549-SUCLG2WT細胞相比，A549-SUCLG2K93R細胞的mtDNA拷貝數減少了（圖8G）。作者還發現，與 A549-SUCLG2WT 細胞相比，ROS 在 A549-SUCLG2K93R 細胞中明顯積累（圖 8H）。A549-SUCLG2WT細胞中的ATP含量高于A549-SUCLG2K93R細胞（圖8I）。作者的研究結果表明，A549-SUCLG2WT 的線粒體功能優于 A549-SUCLG2K93R。接下來，作者在 A549-SUCLG2WT 和 A549-SUCLG2K93R 細胞中進行了細胞增殖試驗。結果顯示，SUCLG2K93R 突變體抑制了細胞增殖（圖 8J）。然后，作者在異種移植模型中評估了 A549-SUCLG2K93R 細胞的腫瘤發生情況。與A549-SUCLG2WT相比，A549-SUCLG2細胞的異種移植物顯示腫瘤重量和體積減少（圖8K-M），IHC結果顯示，與SUCLG2WT腫瘤相比，SUCLG2K93R突變體腫瘤的Ki67表達減少，TTF1表達增加（圖8N）。這些結果表明，抑制SUCLG2在K93上的琥珀酰化會導致線粒體功能障礙，減少LUAD細胞的腫瘤發生。

結論：

        綜上所述，作者的研究闡明了SUCLG2在線粒體功能障礙中的作用，闡明了SUCLG2在LUAD中琥珀酰化介導的蛋白平衡機制，從而為開發靶向SUCLG2的抗腫瘤藥物提供了理論依據。

實驗方法：

        RT-qPCR檢測、免疫印跡和蛋白質印跡、免疫熒光檢測、免疫組化、mtDNA提取和分析、ATP生產測量、線粒體和胞質溶膠提取、MDH2活性的測量、IDH2活性的測量、ME2活性的測量、GAPDH活性的測量、琥珀酰基4D質譜分析、非靶向代謝組學、細胞培養和轉染、細胞增殖檢測、transwell遷移檢測和劃痕傷口愈合檢測、CRISPR-Cas9介導的基因破壞、細胞內ROS檢測、體內異種移植檢測

參考文獻：

        Hu, Q., Xu, J., Wang, L., Yuan, Y., Luo, R., Gan, M., Wang, K., Zhao, T., Wang, Y., Han, T., Wang, J.-B., SUCLG2 Regulates Mitochondrial Dysfunction through Succinylation in Lung Adenocarcinoma. Adv. Sci. 2023, 2303535.