簡(jiǎn)介

       急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一種罕見(jiàn)的侵襲血液及骨髓的腫瘤，是白血病家族中成年人最常見(jiàn)的類型之一，它進(jìn)展快速，極具侵襲性。患者的5年總生存率不到45%，主要是由于化療或靶向治療后的疾病復(fù)發(fā)。端粒酶在大多數(shù)癌癥包括AML中高度表達(dá)和重新激活，因此它可作為一種治療靶點(diǎn)。伊美司他作為端粒酶抑制劑已被驗(yàn)證在血液系統(tǒng)髓系惡性腫瘤中具有臨床療效，但機(jī)制尚不明確。本研究中作者證明了伊美司他促進(jìn)含有多不飽和脂肪酸的磷脂的形成，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激水平過(guò)高；伊美司他的療效在ROS清除后降低。作者計(jì)劃利用這些機(jī)制開(kāi)發(fā)一種優(yōu)化的治療策略，使用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)化療來(lái)提高患者樣本對(duì)伊美司他的敏感性，從而在AML中實(shí)現(xiàn)疾病控制。該研究于2023年10月30日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF：22.7

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 建立AML患者來(lái)源的人源性組織異種移植（PDX）模型

       成功移植到NSGS中的AML患者樣本隨機(jī)選擇30例，根據(jù)患者年齡、性別、ELN2017預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)、WHO疾病分類等臨床參數(shù)進(jìn)行表征（圖1a-c），發(fā)現(xiàn)17個(gè)樣本來(lái)自女性AML患者（圖1b），OncoPrint圖表明NPM1、DNMT3A、ARID1B和FLT3等基因中經(jīng)常檢測(cè)到致癌突變（圖1c）。總之，作者成功建立了AML患者來(lái)源的PDX模型。

圖1： AML患者樣本的綜合分析

2. AML PDX中伊美司他的II期臨床前試驗(yàn)

       為了驗(yàn)證伊美司他在AML中的臨床前療效，將30個(gè)AML患者樣本分別移植到12個(gè)NSGS受體（n=360個(gè)PDX）中。出現(xiàn)AML負(fù)荷后，將PDX隨機(jī)分為伊美司他治療組和載體（PBS）對(duì)照治療組，治療至少持續(xù)30天。與對(duì)照組相比，伊美司他治療的中位生存期顯著延長(zhǎng)（圖2a），外周血供體嵌合、骨髓細(xì)胞和供體嵌合、AML患者衍生細(xì)胞數(shù)量以及脾臟供體嵌合顯著減少（圖2b-g）。作者還評(píng)估了與白血病起始活性相關(guān)的AML表面標(biāo)記物的變化（圖2h）。脾臟AML細(xì)胞群中富集的CD34⁺CD38^-白血病干細(xì)胞在伊美司他治療后顯著降低（圖2i）。

       接下來(lái)作者評(píng)估了PDX中伊美司他治療的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，與對(duì)照組相比，伊美司他治療的AML供體細(xì)胞顯著富集了功能注釋為干擾素信號(hào)、細(xì)胞周期、TP53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和MAPK信號(hào)的基因（圖2j，k）；同時(shí)，AML供體細(xì)胞中TERT mRNA在治療后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2l）），但端粒長(zhǎng)度無(wú)明顯變化（圖2m，n）。

圖2： 伊美司他在AML PDX的隨機(jī)II期臨床前試驗(yàn)中的療效

3. CRISPR/Cas9篩選識(shí)別伊美司他的關(guān)鍵效應(yīng)物

       作者使用人類全基因組敲除文庫(kù)（Brunello文庫(kù)）進(jìn)行陽(yáng)性篩選以鑒定對(duì)伊美司他產(chǎn)生耐藥性的基因，聯(lián)合RIGER和STARS算法確定了七個(gè)功能基因：脂肪酸去飽和酶2（FADS2）、酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（ACSL4）、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶17A（TIMM17A）、晚期內(nèi)體/溶酶體銜接子、MAPK和MTOR激活劑1-3（LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3）和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈相互作用蛋白（MYLIP）（圖3a）；它們?cè)谡{(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、鐵離子結(jié)合、線粒體基質(zhì)和溶酶體生物發(fā)生和定位等功能上具有密切關(guān)系（圖3b）。作者隨后進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，確定FADS2或ACSL4功能喪失會(huì)導(dǎo)致伊美司他治療的AML細(xì)胞具有競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（圖3c-f）。當(dāng)使用CD33（預(yù)測(cè)對(duì)細(xì)胞功能有中性影響）敲除或空載對(duì)照時(shí)，伊美司他治療后未觀察到競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)（圖3c-f）。上述結(jié)果表明ACSL4和FADS2是伊美司他在AML治療中的關(guān)鍵效應(yīng)物。

圖3： 利用全基因組CRISPR/Cas9缺失鑒定伊美司他療效的關(guān)鍵介質(zhì)

4. 伊美司他是鐵死亡的誘導(dǎo)劑

       多不飽和脂肪酸（PUFA）磷脂合成的關(guān)鍵酶受到ACSL4和FADS2的編碼調(diào)節(jié)。作者發(fā)現(xiàn)在NB4細(xì)胞中，伊美司他治療后PUFA磷脂顯著富集，FADS2缺失則減少了這種脂質(zhì)的富集（圖4a）。這表明伊美司他以FADS2依賴性的方式誘導(dǎo)PUFA磷脂合成。

       ACSL4被認(rèn)為是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。鐵死亡的標(biāo)志之一是脂質(zhì)過(guò)氧化，因此ACSL4與脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)。為了驗(yàn)證伊美司他與脂質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)系，作者用C11-BODIPY（脂質(zhì)過(guò)氧化熒光探針）處理AML細(xì)胞，圖5b可以看出伊美司他治療后熒光強(qiáng)度顯著增加，這表明伊美司他在體外誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化。接下來(lái)作者評(píng)估了活性氧（ROS）是否也受到伊美司他影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，伊美司他治療后ROS顯著增加，當(dāng)加入活性氧清除劑Ferrostatin-1后，增加變少了，這表明伊美司他促進(jìn)AML細(xì)胞中的ROS生成（圖5a）。在ACSL4或FADS2功能缺失的AML細(xì)胞中，脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS生成明顯降低，表明伊美司他誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS產(chǎn)生依賴于體外功能性FADS2和ACSL4（圖4b，c）。AML PDX模型中體內(nèi)驗(yàn)證了伊美司他誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化與ACSL4表達(dá)增加有關(guān)（圖5c）；liproxstatin處理不僅抑制伊美司他誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS生成（圖5d，e），而且降低了伊美司他的療效（圖5f）。

       以上數(shù)據(jù)表明伊美司他通過(guò)ACSL4和FADS2介導(dǎo)的PUFA代謝、過(guò)度脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激改變誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。

圖4： 伊美司他是鐵死亡的有效誘導(dǎo)劑

圖5： ROS清除降低伊美司他療效

5. 脂代謝先于伊美司他誘導(dǎo)的鐵死亡

       通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能遺傳學(xué)綜合研究伊美司他誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制。作者在Brunello文庫(kù)和AML PDX RNA-seq數(shù)據(jù)集中取交集，確定了11個(gè)伊美司他靶點(diǎn)候選物（圖6a），其中兩種VIM（波形蛋白）和LMNA（核纖層蛋白A/C），是共調(diào)節(jié)模塊的一部分（圖6a），最近被鑒定為端粒G-四鏈體結(jié)合蛋白。VIM除了結(jié)合端粒G-四鏈體外，還是脂滴生物發(fā)生和穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)成分。

       作者假設(shè)伊美司他誘導(dǎo)的PUFA磷脂合成、氧化應(yīng)激和鐵死亡由脂噬引起。AML細(xì)胞中VIM高度表達(dá)（圖6b），VIM功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞在伊美司他治療后具有競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（圖6c）。利用C12-BODIPY（一種脂滴的熒光脂肪酸探針）和LAMP1（晚期內(nèi)體標(biāo)記物）評(píng)估脂噬，發(fā)現(xiàn)脂滴與內(nèi)體的共定位顯著增加，表明脂噬增加（圖6d）。通過(guò)氯喹抑制脂噬后伊美司他誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也隨之減少（圖6e）。

       上述結(jié)果證明了AML中伊美司他的作用機(jī)制：通過(guò)調(diào)控端粒G-四鏈體結(jié)合蛋白干擾脂滴結(jié)構(gòu)成分導(dǎo)致脂滴穩(wěn)態(tài)受損，發(fā)生脂噬，最終誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生。

圖6：轉(zhuǎn)錄組學(xué)與功能遺傳學(xué)的綜合分析

6. 氧化應(yīng)激信號(hào)分辨持續(xù)應(yīng)答

       作者接下來(lái)尋找伊美司他反應(yīng)和耐藥的生物標(biāo)志物。對(duì)585個(gè)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中頻繁突變的基因的綜合組織進(jìn)行基因組測(cè)序得到數(shù)據(jù)，觀察到信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞粘附/代謝相關(guān)基因的致癌突變更頻繁（圖7a）。突變型NRAS與伊美司他治療的反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，與AML PDX中野生型NRAS相比，突變型NRAS減少AML負(fù)荷，提高存活率（圖7b，c）。此外， AML患者樣本中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)在持續(xù)應(yīng)答伊美司他的樣本中，翻譯/病毒感染相關(guān)的基因呈陽(yáng)性富集，細(xì)胞周期、抗病毒免疫、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和血紅素清除相關(guān)的基因呈陰性富集（圖7d）。Hallmark特征顯示，持續(xù)應(yīng)答伊美司他與細(xì)胞凋亡、干擾素-α反應(yīng)、DNA修復(fù)、TP53途徑、過(guò)氧化物酶體、脂肪酸代謝和ROS生成途徑有關(guān)（圖7e）。

       接下來(lái)，作者研究了端粒長(zhǎng)度是否與伊美司他應(yīng)答相關(guān)。通過(guò)端粒限制性片段（TRF）分析確定端粒長(zhǎng)度，長(zhǎng)度范圍在2.7-12 kb，30例AML患者樣本中有5例含有多個(gè)端粒長(zhǎng)度不同的亞克隆（圖7f），表明基線端粒長(zhǎng)度和伊美司他應(yīng)答無(wú)相關(guān)性（圖7f）。

       上述結(jié)果表明伊美司他在大多AML PDX中有效。此外，對(duì)伊美司他的持續(xù)應(yīng)答與基線端粒長(zhǎng)度無(wú)關(guān)，與NRAS突變和氧化應(yīng)激基因有關(guān)。

圖7：突變NRAS和氧化應(yīng)激基因表達(dá)特征與對(duì)伊美司他的持續(xù)應(yīng)答相關(guān)

7. 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)AML PDX對(duì)伊美司他敏感

       AML誘導(dǎo)緩解治療的標(biāo)準(zhǔn)方案是蒽環(huán)類藥物聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)劑量阿糖胞苷。為了探究該療法是否能使AML細(xì)胞對(duì)伊美司他治療敏感，作者用阿糖胞苷聯(lián)合阿霉素預(yù)處理AML細(xì)胞，隨后用伊美司他治療，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療以劑量依賴性的方式顯著增加ROS水平和細(xì)胞死亡（圖8a，b）。

       NRAS野生型AML PDX模型在單劑量標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療后使用伊美司他導(dǎo)致體內(nèi)ROS水平顯著增加（圖8c）。早期治療組之間的脂質(zhì)過(guò)氧化沒(méi)有顯著差異（圖8c）；但在經(jīng)過(guò)完整的誘導(dǎo)化療周期后使用伊美司他治療發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS水平顯著增加（圖8d）。

       隨后，作者在20例AML患者樣本來(lái)源的不同PDX（n=480）中依次給予標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療，再進(jìn)行伊美司他治療（圖8e）。與對(duì)照治療、伊美司他單獨(dú)治療、單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療（圖8f）相比，聯(lián)合治療組的AML負(fù)荷顯著降低（圖8g）。

       上述數(shù)據(jù)表明用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療誘導(dǎo)氧化應(yīng)激可使AML細(xì)胞對(duì)伊美司他誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡更敏感，顯著改善治療效果（圖8h）。

圖8：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)和標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療使AML細(xì)胞對(duì)伊美司他敏感

結(jié)論

        通過(guò)開(kāi)發(fā)和利用AML PDX資源庫(kù)和人類細(xì)胞系，結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)，作者證明伊美司他是鐵死亡的誘導(dǎo)劑，可減輕患者AML負(fù)荷并延緩化療后的復(fù)發(fā)。作者證明對(duì)AML患者采用序貫治療即先采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療隨后利用伊美司他鞏固療效，這一治療方式可顯著延遲或預(yù)防AML的復(fù)發(fā)。后續(xù)臨床試驗(yàn)將重點(diǎn)關(guān)注伊美司他在預(yù)防AML復(fù)發(fā)或與靶向治療一起改善AML患者預(yù)后的作用。

實(shí)驗(yàn)方法

小鼠模型，異種移植實(shí)驗(yàn)，藥物治療研究，血液分析，流式細(xì)胞術(shù)，qPCR，細(xì)胞培養(yǎng)和體外細(xì)胞生長(zhǎng)分析，蛋白質(zhì)印跡，共聚焦顯微鏡，突變測(cè)序，RNA測(cè)序，脂質(zhì)組學(xué)

參考文獻(xiàn)

Bruedigam C, Porter AH, Song A, et al. Imetelstat-mediated alterations in fatty acid metabolism to induce ferroptosis as a therapeutic strategy for acute myeloid leukemia [published online ahead of print, 2023 Oct 30]. Nat Cancer. 2023;10.1038/s43018-023-00653-5. doi:10.1038/s43018-023-00653-5.