轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸衍生片段（tRFs）是一類小非編碼調(diào)控RNAs，與許多疾病的病理生理學(xué)有關(guān)。然而，tRFs 在癌癥進(jìn)展中的作用在很大程度上仍然難以捉摸。本研究證明泛癌癥3′-tRF CAT1（癌癥相關(guān)tRF 1）在腫瘤中普遍上調(diào)，并與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的不良預(yù)后相關(guān)。機(jī)制上，癌細(xì)胞中上調(diào)的CAT1與具有多重剪接功能的 RNA 結(jié)合蛋白（RBPMS）結(jié)合，取代NOTCH2與RBPMS 的聯(lián)系，從而抑制隨后由CCR4-NOT脫腺苷化復(fù)合物介導(dǎo)的NOTCH2 mRNA衰減。該研究于2023年8月發(fā)表在《Cell Reports》，IF：8.8。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 泛癌CAT1上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，與癌癥患者預(yù)后不良相關(guān)

       為確定CAT1在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的確切作用，分析小RNA測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)，結(jié)果表明CAT1是一個(gè)18-nt的3′-tRF，它是由攜帶對(duì)應(yīng)于氨基酸L-丙氨酸的反密碼子AGC（即tRNA-Ala-AGC-1-1）的only tRNA isodecoder的TψC環(huán)切割產(chǎn)生的（圖1A，右）。dumbbell-聚合酶鏈反應(yīng)（Db-PCR）產(chǎn)物的Sanger測(cè)序驗(yàn)證腫瘤標(biāo)本中CAT1的18-nt序列（圖1A，左），Db-PCR是一種改良的TaqMan實(shí)時(shí)qPCR方法，可以單堿基分辨率對(duì)RNA片段的5?和3?端變異體進(jìn)行特異性定量（圖1A，左）。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集的分析表明，CAT1在許多類型的腫瘤組織中顯著上調(diào)（圖1B）。值得注意的是，其高表達(dá)強(qiáng)烈預(yù)測(cè)各種癌癥類型患者的短生存期（圖1C）。與此一致，對(duì)一組獨(dú)立的癌癥標(biāo)本進(jìn)行的Db-PCR分析證實(shí)，與健康標(biāo)本相比，CAT1在大多數(shù)癌癥類型中高度豐富，且表達(dá)上調(diào)（圖1D）。鑒于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是全球癌癥相關(guān)死亡率的主要原因，因此選擇肺癌細(xì)胞系（A549和Calu1）作為評(píng)估CAT1在癌癥中的功能的主要模型。正如預(yù)期的那樣，CAT1不僅在肺癌組織中上調(diào)（圖1B和1D），而且其高表達(dá)還與較差的預(yù)后相關(guān)。值得注意的是，對(duì)30例NSCLC患者和25例健康對(duì)照者血漿標(biāo)本的Db-PCR分析表明，CAT1在肺癌患者血漿中的表達(dá)顯著且持續(xù)高于健康對(duì)照者（圖1E）。綜上所述，這些結(jié)果表明CAT1在癌組織和NSCLC患者血漿中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。CAT1敲低降低肺癌細(xì)胞的增殖（圖1F）、遷移（圖1G）和侵襲（圖1G）。此外，CAT1敲除誘導(dǎo)G1期阻滯（圖1H）。

圖1. 泛癌CAT1上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，與癌癥患者預(yù)后不良相關(guān)

2. CAT1和RBPMS通過相互作用協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)

       為闡明CAT1調(diào)控癌細(xì)胞的機(jī)制，使用合成的3′-生物素化CAT1在A549細(xì)胞中進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)。免疫印跡分析表明RBPMS是一種相關(guān)蛋白，而CAT1反義鏈未與RBPMS結(jié)合（圖2A）。同樣，在A549細(xì)胞中使用抗RBPMS抗體進(jìn)行的RNA免疫沉淀（RIP）檢測(cè)證實(shí)，RBPMS與CAT1結(jié)合，但未與其他tRFs結(jié)合，如5′-IleAAT-8-1-L20 （Ile-20，陰性對(duì)照）（圖2B）。CAT1在3′末端含有CAC RRE，RNA下拉實(shí)驗(yàn)表明，含有GGG取代CAC的CAT1突變體降低CAT1與RBPMS的結(jié)合（圖2C）。與這一發(fā)現(xiàn)一致，缺失RRM結(jié)構(gòu)域的RBPMS突變體失去與CAT1的關(guān)聯(lián)（圖2D）。這些結(jié)果表明CAT1與RBPMS蛋白的相互結(jié)合依賴于CAT1中的CAC RRE被RBPMS的RRM結(jié)構(gòu)域識(shí)別。利用RNA-seq對(duì)CAT1敲低（圖2E）和RBPMS敲除細(xì)胞進(jìn)行無(wú)偏轉(zhuǎn)錄組分析（圖2F）。這項(xiàng)分析顯示，5,873個(gè)基因在CAT1敲低時(shí)發(fā)生改變，3,777個(gè)基因在RBPMS敲低時(shí)發(fā)生改變，其中1,321個(gè)基因在RBPMS敲低細(xì)胞和CAT1敲低細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生改變（圖2G）。觀察到的1,321個(gè)改變基因的數(shù)量顯著高于在RBPMS敲除和CAT1敲除細(xì)胞中偶然同時(shí)發(fā)生的改變基因的數(shù)量（p=1.06E71），表明CAT1和RBPMS協(xié)同調(diào)節(jié)一些改變基因的表達(dá)。此外，RBPMS-RIP-seq顯示，1,741個(gè)包含CAC RREs的基因與RBPMS結(jié)合，其中176個(gè)與RBPMS和CAT1可能共同調(diào)節(jié)的1,321個(gè)基因重疊（圖2G）。然后對(duì)這176個(gè)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)其中25個(gè)基因與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，這與CAT1對(duì)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的強(qiáng)調(diào)控（圖1H）很好地吻合。對(duì)這些驗(yàn)證基因的FLAG-RBPMS-RIP分析顯示，除LIG4外，其他8個(gè)基因與RBPMS相關(guān)，但與RRM截短突變體無(wú)關(guān)，其中相對(duì)富集度最高的是NOTCH2（圖2H）。這些結(jié)果表明，CAT1和RBPMS通過相互作用協(xié)同調(diào)節(jié)包括NOTCH2在內(nèi)的mRNA的表達(dá)。

圖2. CAT1和RBPMS通過相互作用協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)

3. CAT1與RBPMS結(jié)合抑制CCR4-NOT脫腺苷化復(fù)合物介導(dǎo)的NOTCH2 mRNA衰減

       NOTCH2在腫瘤中常被過度表達(dá)或突變，可上調(diào)CCND1的表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在G0/G1期和細(xì)胞增殖。使用抗RBPMS抗體對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行RIP分析，結(jié)果表明，CAT1的過表達(dá)（與RBPMS呈劑量依賴性結(jié)合）（圖3A）以CAT1表達(dá)依賴性的方式降低RBPMS相關(guān)NOTCH2 mRNA的富集（圖3B），同時(shí)細(xì)胞NOTCH2 mRNA總表達(dá)相應(yīng)增加（圖3C）。此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄的Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD） RNA進(jìn)行的電泳遷移率變化分析（EMSA）表明，純化的RBPMS與合成的3′-生物素化CAT1結(jié)合，并且這種結(jié)合以依賴于NICD RNA劑量的方式減少（圖3D）。這些結(jié)果表明CAT1和NOTCH2 mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RBPMS，并且CAT1與RBPMS的結(jié)合取代NOTCH2 mRNA與RBPMS的結(jié)合。值得注意的是，在用Dactinomycin處理的肺癌細(xì)胞中敲低CAT1，抑制重新轉(zhuǎn)錄，從而消除轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，使NOTCH2 mRNA的半衰期縮短（圖3E），而過表達(dá)CAT1（圖3F）或去除RBPMS（圖3G）則延長(zhǎng)NOTCH2 mRNA的半衰期。重要的是，CNOT1敲低挽救了CAT1敲低引起的NOTCH2半衰期縮短（圖3H、3I）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，通過siRNA（圖3J和3K）敲除CAT1降低NOTCH2的mRNA和蛋白水平，而這種降低可通過敲除RBPMS（圖3L和3M）或CNOT1（圖3N和3I）來(lái)消除。相反，CAT1過表達(dá)（圖3C）或RBPMS敲低（圖3O和3P）增加NOTCH2 mRNA和蛋白的表達(dá)。接下來(lái)研究CAT1和RBPMS對(duì)notch2介導(dǎo)的CCND1、CDK4和EMT標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，敲除RBPMS（圖3P）增加了這些蛋白的表達(dá)，并且敲除RBPMS可消除CAT1誘導(dǎo)的減少（圖3M）。總之，這些結(jié)果表明，CAT1與RBPMS的結(jié)合減弱了RBPMS與NOTCH2 mRNA關(guān)聯(lián)，并抑制隨后CCR4-NOT脫腺苷化復(fù)合物介導(dǎo)的NOTCH2 mRNA衰變，從而上調(diào)NOTCH2的表達(dá)

圖3. CAT1與RBPMS結(jié)合抑制CCR4-NOT脫腺苷化復(fù)合物介導(dǎo)的NOTCH2 mRNA衰減

4. CAT1通過上調(diào)NOTCH2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖

       接下來(lái)檢測(cè)CAT1介導(dǎo)的和RBPMS以及CNOT1依賴的NOTCH2上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響。發(fā)現(xiàn)，NOTCH2過表達(dá)恢復(fù)CAT1缺失誘導(dǎo)的G1期阻滯（圖4A）以及肺癌細(xì)胞增殖（圖4B）、遷移和侵襲（圖4C）的減少。通過過表達(dá)NOTCH2, CAT1敲低抑制的CCND1和CDK4以及EMT標(biāo)志物的相應(yīng)表達(dá)水平也中度恢復(fù)（圖4D）。相反，CAT1過表達(dá)促進(jìn)從G1期向S期（G1/S）的轉(zhuǎn)變（圖4E）、細(xì)胞增殖（圖4F）、遷移和侵襲（圖4G）。同樣，NOTCH2敲低后，CAT1過表達(dá)引起的CCND1和CDK4以及EMT標(biāo)志物水平升高有所降低（圖4H）。這些數(shù)據(jù)表明CAT1通過抑制RBPMS/ CCR4-NOTCH2介導(dǎo)的NOTCH2 mRNA的衰減促進(jìn)肺癌細(xì)胞周期進(jìn)程以及增殖和侵襲。

圖4. CAT1通過上調(diào)NOTCH2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖

5. CAT1通過上調(diào)NOTCH2促進(jìn)小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

       將敲除CAT1的A549細(xì)胞接種于BALB/c裸鼠皮下，觀察CAT1在A549細(xì)胞成瘤中的作用。CAT1缺失顯著減小腫瘤大小（圖5A）、體積（圖5B）和重量（圖5C）。將CAT1敲除后表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的Calu1細(xì)胞尾靜脈注射至裸鼠體內(nèi)。生物發(fā)光成像顯示，CAT1敲除大大降低小鼠轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的生長(zhǎng)（圖5D）和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量（圖5E）。Calu1細(xì)胞中CAT1過表達(dá)顯著增加腫瘤大小（圖5F）、體積（圖5G）、重量（圖5H），而這種增加被NOTCH2敲除抑制（圖5F - 5H）。對(duì)腫瘤組織的實(shí)時(shí)qPCR和免疫組化分析表明，CAT1敲除降低NOTCH2 mRNA表達(dá)（圖5I），相應(yīng)降低NOTCH2蛋白水平（圖5J）。相反，CAT1過表達(dá)增強(qiáng)腫瘤組織中NOTCH2 mRNA表達(dá)（圖5K），相應(yīng)增加NOTCH2蛋白水平（圖5L），而這種增加被NOTCH2敲除消除（圖5K和5L）。這些數(shù)據(jù)表明CAT1通過上調(diào)NOTCH2促進(jìn)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

圖5. CAT1通過上調(diào)NOTCH2促進(jìn)小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

圖6. CAT1介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展調(diào)節(jié)示意圖

結(jié)論

       綜上所述，本研究證明泛癌3′-tRF，CAT1，在腫瘤中普遍上調(diào)，并與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的不良預(yù)后相關(guān)。揭示了癌癥特異性CAT1上調(diào)與癌癥進(jìn)展之間的內(nèi)在聯(lián)系，顯示了3′-tRF對(duì)癌癥中NOTCH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，并凸顯了其巨大的臨床潛力。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用CRISPR/Cas9生成基因敲除細(xì)胞系，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，體外遷移及侵襲試驗(yàn)，細(xì)胞周期分析，RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，血漿RNA提取，tRF的Dumbbell-PCR，四葉草RT-qPCR檢測(cè)成熟tRNA，WB，Northern blot，RNA pull-down，RIP，Co-IP，體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，EMSA，RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，基因過表達(dá)，免疫組化，RNA-seq和數(shù)據(jù)分析，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

Yu M, Yi J, Qiu Q, Yao D, Li J, Yang J, Mi C, Zhou L, Lu B, Lu W, Ying K, Chen W, Chen E, Zhang H, Lu Z, Lu Y, Liu P. Pan-cancer tRNA-derived fragment CAT1 coordinates RBPMS to stabilize NOTCH2 mRNA to promote tumorigenesis. Cell Rep. 2023 Nov 8;42(11):113408. doi: 10.1016/j.celrep.2023.113408. Epub ahead of print. PMID: 37943661.