轉移仍然是鼻咽癌(NPC)患者治療失敗的主要原因，其中Notch信號的持續激活起著關鍵作用。m6A介導的轉錄后調控參與Notch信號輸出的微調；然而，鼻咽癌轉移的轉錄后機制仍然知之甚少。在本研究中，我們報道了IGF2BP3在鼻咽癌中是一個關鍵的m6A閱讀器。IGF2BP3在轉移性鼻咽癌中表達顯著上調，并與鼻咽癌患者預后不良相關。IGF2BP3過表達促進了，而IGF2BP3下調抑制了鼻咽癌細胞的腫瘤轉移和鼻咽癌細胞的干性表型。機制上，IGF2BP3以m6A依賴的方式通過抑制CCR4-NOT復合物介導的去腺苷酸化來維持NOTCH3 mRNA的穩定性，從而維持NOTCH3信號的激活并增加干性相關下游基因的轉錄，最終促進腫瘤轉移。我們的研究結果強調了IGF2BP3/Notch3軸的促轉移功能，并揭示了IGF2BP3在Notch3轉錄后調控中的確切作用，提示IGF2BP3是一種新的預后生物標志物和潛在的鼻咽癌轉移治療靶點。本文于2023年10月發表于Oncogene（IF=8）上。

技術路線

結果

1）IGF2BP3在鼻咽癌中表達上調，與轉移和不良預后相關

       我們探索了NPC中關鍵的m6A閱讀器。對13例鼻咽癌和5例正常鼻咽上皮樣本進行RNA測序分析。針對這些m6A閱讀器，IGF2BP3 mRNA水平在NPC中顯著上調(圖1A)。值得注意的是，我們額外收集了13個冷凍組織檢測IGF2BP3 mRNA和蛋白水平，與正常組織相比，IGF2BP3在NPC組織中的表達水平明顯升高。特別是在轉移性鼻咽癌組織中(圖1B)。在183個石蠟包埋的鼻咽癌標本中，使用免疫組織化學(IHC)評估IGF2BP3表達的臨床意義(圖1C)。183例NPC患者中IGF2BP3高表達104例。相關分析顯示，IGF2BP3高表達與鼻咽癌遠處轉移顯著相關(圖1D)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，IGF2BP3高表達與鼻咽癌患者較短的總生存期(OS)和遠端無轉移生存期(DMFS)相關(圖1 E)。多因素Cox回歸分析顯示，IGF2BP3表達水平被確定為鼻咽癌患者OS和DMFS的獨立預后因素(圖1F)。總的來說，這些發現表明IGF2BP3上調與鼻咽癌轉移相關。

2）IGF2BP3調節鼻咽癌的腫瘤轉移

       在腫瘤轉移過程中，大量癌細胞從原發腫瘤擴散，但只有一小部分DTC通過浸潤遠端器官存活。為了探索IGF2BP3是否影響這一低效率過程，我們選擇了IGF2BP3表達水平中等的HONE1和SUNE1細胞系，過表達或敲低IGF2BP3(圖2A)。引人注意的是，IGF2BP3的上調顯著促進了鼻咽癌細胞的體外非錨定生長，而IGF2BP3的沉默抑制了鼻咽癌細胞的體外非錨定生長(圖2B, 2C)。此外，我們構建了裸鼠肺轉移異種移植模型。將指定的熒光素酶表達細胞(SUNE1-Vector、SUNE1-IGF2BP3、SUNE1-Scramble、SUNE1-shIGF2BP3#1、SUNE1-shIGF2BP3#2)靜脈注射到裸鼠尾靜脈。與對照組相比，IGF2BP3過表達顯著增強，而IGF2BP3沉默使肺內生物發光強度降低(圖2D、2E)。注射后6周切除肺后，IGF2BP3過表達組小鼠肺表面腫瘤淋巴結比對照組多。相比之下，IGF2BP3沉默顯著減少了肺內彌散性腫瘤結節的數量(圖2F, 2G)。此外，Ki67染色證實IGF2BP3過表達組小鼠的腫瘤具有更好的增殖潛力(圖2F–2H)。提示IGF2BP3促進鼻咽癌遠處轉移。

3）IGF2BP3促進鼻咽癌的干性

       DTC的生存和腫瘤啟動活性在轉移性定植中起著重要作用。成球實驗顯示，IGF2BP3過表達后，與載體對照組相比，形成了更多更大的球體。與scramble組相比，IGF2BP3沉默導致的球體更少、更小(圖3A)。此外，IGF2BP3過表達組的側群(SP)細胞比例增加，而IGF2BP3敲低組的側群(SP)細胞比例減少(圖3B)。同樣，IGF2BP3過表達顯著增加了細胞干性標志物NANOG、OCT4和CD44的水平，但在IGF2BP3沉默的細胞中卻降低了(圖3C)。IGF2BP3的上調導致腫瘤發生率顯著升高和異種移植物生長加快。相反，IGF2BP3沉默的細胞表現出較低的腫瘤發生率和較慢的異種移植物生長(圖3D-3F)。IGF2BP3過表達會增加腫瘤起始細胞(TIC)頻率，而IGF2BP3沉默則會產生相反的效果(圖E)。這些結果表明，IGF2BP3在維持NPC腫瘤的干性中起著至關重要的作用。

4）IGF2BP3通過穩定Notch3 mRNA促進Notch3通路的激活

       為了確定IGF2BP3影響CSC特性和鼻咽癌轉移的分子機制，我們檢測了幾種經典的干細胞相關信號通路的活性，包括Hedgehog, Hippo, Notch, STAT3和Wnt/β-catenin通路。IGF2BP3在HONE1和SUNE1細胞中的過表達顯著增加了Notch信號通路的轉錄活性，但沒有引起其他信號通路的顯著變化(圖4A)。我們分析了RNA-seq數據，發現IGF2BP3和NOTCH3的mRNA水平之間存在顯著的正相關，而其他Notch家族成員的mRNA水平之間沒有顯著的正相關(圖4B)。TCGA HNSC數據集也證實了這種正相關(圖4C)。此外，IGF2BP3的上調顯著促進了NOTCH3的表達，而IGF2BP3的下調則大大降低了NOTCH3的mRNA和蛋白水平，而不影響NOTCH3的轉錄(圖4D、4E)。與此一致的是，IGF2BP3過表達增加了Notch信號靶基因HES1和MYC的表達(圖D)。熒光素酶報告基因檢測顯示，IGF2BP3過表達促進了，而IGF2BP3沉默顯著削弱了HES1和MYC啟動子的熒光素酶活性(圖4E)。同樣，IGF2BP3的異位表達可以有效促進，而IGF2BP3的下調會損害腫瘤中NOTCH3的mRNA水平和NOTCH3信號的激活(圖4F)。接下來，我們研究了Dactinomycin處理不同時間NOTCH3 mRNA的穩定性。IGF2BP3的敲低顯著降低，而IGF2BP3的過表達顯著增加了NOTCH3 mRNA的穩定性和半衰期(圖4G)。GSI治療和沉默NOTCH3顯著削弱了IGF2BP3介導的腫瘤啟動能力(圖4H, 4I)。抑制NOTCH3導致IGF2BP3誘導的鼻咽癌細胞轉移顯著減少(圖4J)。這些結果表明，IGF2BP3穩定NOTCH3 mRNA，維持NOTCH3通路激活，促進鼻咽癌腫瘤轉移。

5）IGF2BP3以m6A依賴的方式促進NOTCH3 mRNA的穩定性

       隨后，我們發現NOTCH3 mRNA序列在鼻咽癌細胞中富集了m6A修飾(圖5A)。在鼻咽癌細胞中進行的內源性RNA免疫沉淀(RIP)試驗證實，IGF2BP3持續與NOTCH3轉錄本相互作用(圖5B)。在線RNA修飾網站(SRAMP)預測了NOTCH3 CDS內的5個高置信度m6A位點。NOTCH3 mRNA與IGF2BP3之間的直接結合也被所有推測m6A位點的突變所破壞(圖5C, 5D)。為了研究哪個m6A位點負責m6A介導的NOTCH3穩定，設計了5個NOTCH3突變體，并進行雙熒光素酶報告基因檢測(圖5E)。IGF2BP3的過表達促進了除NOTCH3-mut4外所有NOTCH3突變體的熒光素酶表達，表明位點4 (' GUGGACU ')參與調節NOTCH3的穩定性(圖5F)。我們發現使用METTL3的特異性siRNA或抑制劑降低了NOTCH3的m6A修飾，最終降低了NOTCH3在鼻咽癌細胞中的表達(圖5G)。此外，RIP實驗結果表明，METTL3的缺失顯著抑制了IGF2BP3上NOTCH3的富集(圖5H)。mRNA穩定性分析表明，即使NOTCH3具有高水平的m6A修飾，IGF2BP3的缺失也會顯著降低NOTCH3 mRNA的半衰期(圖5I)。總體而言，這些發現表明IGF2BP3以依賴于m6A的方式促進NOTCH3 mRNA的穩定性。

       為了研究IGF2BP3介導的NOTCH3的增加是否與CCR4-NOT復合物介導的去腺苷酸化有關，我們進行了外源性RIP實驗。結果表明，過表達IGF2BP3顯著損害了NOTCH3與CCR4或CCR4相關因子1 (CAF1)之間的結合(圖5J)。此外，在IGF2BP3過表達的細胞中，過表達CCR4和CAF1會略微加速NOTCH3-wt報告基因的去腺苷酸化，而這種加速在NOTCH3-mut報告基因中或通過添加METTL3特異性抑制劑而增強，這表明m6A修飾可以保護NOTCH3免受CCR4-NOT復合物介導的去腺苷酸化(圖5K)。綜上所述，這些結果表明IGF2BP3通過以m6A依賴的方式抑制CCR4-NOT復合物介導的去腺苷酸化，促進了NOTCH3 mRNA的穩定性。

6）臨床相關性和研究模型

       最后，我們研究了IGF2BP3/Notch3軸是否與鼻咽癌的臨床相關。與未發生轉移的鼻咽癌患者相比，來自轉移性鼻咽癌患者的鼻咽癌原發腫瘤樣本中IGF2BP3和N3ICD水平顯著上調(圖6A)。免疫組化染色和相關分析顯示，臨床樣本中IGF2BP3與N3ICD水平呈正相關(圖6B、6C)。高N3ICD水平與NPC患者較短的OS和DMFS相關(圖6D)。重要的是，IGF2BP3和N3ICD水平較高的患者的OS和DMFS更差(圖6E)。HES1和MYC的高mRNA水平與IGF2BP3和N3ICD的高共表達顯著相關(圖6F)。IGF2BP3和N3ICD高共表達并且HES1和MYC高mRNA水平的患者表現出更短的OS和DMFS(圖6G)，進一步表明IGF2BP3/Notch3軸確實與鼻咽癌的不良臨床結局相關。

結論

       我們的研究結果強調了IGF2BP3在鼻咽癌轉移中的重要作用，并闡明了IGF2BP3介導的NOTCH3轉錄后調控的確切機制，確定了IGF2BP3是一種新的預后生物標志物和潛在的鼻咽癌轉移治療靶點。

實驗方法

實時定量PCR，IHC，RIP，Western blotting，熒光素酶報告基因實驗，異種移植腫瘤模型，RNA穩定性測定。

參考文獻

Chen B, Huang R, Xia T, Wang C, Xiao X, Lu S, Chen X, Ouyang Y, Deng X, Miao J, Zhao C, Wang L. The m6A reader IGF2BP3 preserves NOTCH3 mRNA stability to sustain Notch3 signaling and promote tumor metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene. 2023 Oct 18. doi: 10.1038/s41388-023-02865-6.