多年來，肺損傷一直危害著全球人類的健康，因此對肺損傷的發病機制進行探索和及時干預是非常必要的。Ficolin B（Fcn B）是一種可識別多種配體的識別分子，在介導細胞周期、免疫反應和肺組織穩態中發揮著重要作用。然而，Fcn B在博萊霉素（BLM）誘導的肺損傷中的作用尚不明確。本研究旨在探討Fcn B在博萊霉素誘導的肺損傷中的來源及其機制。研究選取WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠構建BLM誘導的肺損傷模型。利用肺上皮細胞構建BLM誘導的細胞模型。臨床數據表明，間質性肺病（ILD）患者血漿中的 M-ficolin（Fcn B的同源物）含量升高。在小鼠模型中，巨噬細胞衍生的Fcn B加劇了BLM誘導的肺損傷和肺纖維化。Fcn B進一步促進了自噬和鐵死亡的發展。值得注意的是，細胞實驗結果顯示，BLM誘導的AMs外泌體轉運的Fcn B通過激活cGAS-STING通路加速了肺上皮細胞的自噬和鐵死亡。與此相反，3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制自噬依賴性鐵死亡，逆轉了BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B對肺上皮細胞損傷的促進作用。同時，在BLM誘導的小鼠模型中，BLM誘導的AMs外泌體分泌的Fcn B的干預作用通過鐵死亡促進了肺損傷和肺纖維化。綜上所述，本研究表明，由AMs外泌體轉運的Fcn B通過cGAS-STING信號通路促進肺上皮細胞鐵死亡，從而加劇了BLM誘導的肺損傷。本文于2023年8月發表于《cell death & disease》，IF=9。
技術路線

主要實驗結果

1.巨噬細胞來源的Fcn B加重BLM誘導的肺損傷和纖維化

       首先，作者的臨床數據顯示，間質性肺病（ILD）患者血漿中L-ficolin（Fcn A的同源物）的濃度與健康人相比無明顯差異，而M-ficolin（Fcn B的同源物）的濃度則明顯升高（圖1A）。為了探討Fcn B對肺損傷的影響，用BLM刺激WT、Fcna-/-和 Fcnb-/-小鼠。在BLM誘導前，WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠的存活率均為100%。然而，BLM誘導的WT小鼠的存活率明顯降低，而BLM誘導的Fcnb-/-（而非 Fcna-/-）小鼠的存活率則略有降低（圖1B）。HE染色證明，BLM誘導后小鼠肺泡結構受到不同程度的損傷，肺泡壁增厚并伴有炎癥浸潤，表明肺損傷模型構建成功。與WT+BLM 組相比，Fcnb-/-+BLM 組的肺泡結構相對完整，炎癥浸潤最少（圖1C）。代表組織纖維化的Masson染色顯示，只有Fcnb-/-+BLM組的肺間質膠原纖維沉積量少于 WT+BLM組（圖1D）。同樣，Fcnb-/-+BLM組BALF中的總蛋白濃度和肺組織中的羥脯氨酸濃度也明顯低于WT+BLM 組（圖1E、F）。此外，Fcnb-/-+BLM組肺組織中α-SMA的表達也明顯低于WT+BLM組（圖1E，F）。此外，與WT+BLM組相比，Fcnb-/-+BLM組小鼠肺中α-SMA的表達明顯下調（圖1G）。BLM誘導后，WT和Fcna-/-小鼠肺部和血液中Fcn B表達的增加主要來自巨噬細胞（部分來自中性粒細胞）（圖1H，I）。與BLM誘導的WT小鼠相比，BLM誘導的Fcnb-/-小鼠肺中巨噬細胞數量明顯減少。這些結果證明巨噬細胞衍生的Fcn B加重了BLM誘導的肺損傷和肺纖維化。

圖1：來自巨噬細胞的Fcn B加重了BLM誘導的肺損傷和纖維化

2.Fcn B促進BLM誘導肺損傷模型中的自噬和鐵死亡

       接下來，為了探索Fcn B加重肺損傷的原因，作者檢測了小鼠模型中與自噬和鐵死亡相關的標志物水平。與WT+BLM組相比，Fcna-/-+BLM組和Fcnb-/-+BLM組的肺組織中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達減少，而p62的表達增加（圖2A）。與WT+BLM組相比，Fcnb-/-+BLM組肺和血清中MDA和Fe2+濃度降低，GSH濃度顯著升高（圖2B）。然后檢測肺組織的ROS水平，結果顯示Fcnb-/-+BLM組明顯低于WT+BLM 組（圖2C）。此外，與WT+BLM組相比，Fcnb-/-+BLM組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL1表達明顯增加，NCOA4表達減少（圖2D、E）。因此，這些結果表明，在BLM誘導的肺損傷模型中，Fcn B可以促進自噬和死亡。

圖2： Fcn B促進BLM誘導的肺自噬和鐵死亡

3.BLM誘導的AMs外泌體加速肺上皮細胞中Fcn B的表達、自噬和鐵死亡

       作者應用外泌體抑制劑GW4869探討其對AMs外泌體功能的影響。BLM誘導后，AMs中Fcn B的mRNA表達上調（圖3A）。在Transwell細胞培養系統中，添加GW4869可抑制外泌體從上腔BLM誘導的AMs向下腔BLM誘導的肺上皮細胞的分泌和遷移（圖3B）。當BLM處理過的肺上皮細胞與BLM處理過的AMs共同培養時，Fcn B的轉錄顯著增加。不幸的是，使用GW4869后這一趨勢被逆轉（圖3C）。隨后，Western印跡結果顯示，BLM處理過的肺上皮細胞與BLM處理過的AMs共同培養后，LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達上調，p62的表達下調。然而，添加GW4869可逆轉這些變化（圖3D, E）。生化檢測進一步表明，與BLM處理過的AMs共同培養會顯著增加BLM處理過的肺上皮細胞中MDA和Fe²⁺ 的濃度，同時降低GSH的濃度。然而，GW4869的存在降低了MDA和Fe²⁺的濃度，但增加了GSH的濃度（圖3F，G）。此外，BLM處理的肺上皮細胞與BLM處理的AMs共培養后，ROS水平和死亡率也明顯升高，但在GW4869條件下則有所下降（圖3H，I）。同時作者發現，BLM處理的肺上皮細胞與BLM處理的AMs共同培養后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達明顯下調，而NCOA4的表達明顯上調。然而，施用GW4869后，上述結果發生了逆轉（圖3J，K）。這些結果表明，AMs中Fcn B的調節可能是參與自噬和鐵死亡的一種機制，從而減輕BLM誘導的肺上皮細胞損傷。

圖3：BLM誘導的AMs外泌體增加Fcn B表達，促進肺上皮細胞自噬和鐵死亡

4.BLM誘導的AMs通過外泌體轉運的Fcn B介導肺上皮細胞自噬和鐵死亡

       為了研究AMs與Fcn B之間的聯系，作者提取了外泌體并進行了一系列表征。NTA結果顯示，大多數外泌體的大小在40到160 nm之間（圖4A）。TEM圖像顯示，外泌體通常呈碟形，呈單一分布（圖4B）。Western 印跡進一步顯示，外泌體中表達了特定的標記物CD9、CD63和CD81（圖4C）。PKH67標記的外泌體被肺上皮細胞成功吸收并分布在細胞核周圍（圖4D）。經BLM處理的肺上皮細胞與經BLM處理的AMs衍生的外泌體共培養后，Fcn B的mRNA表達上調（圖4E）。BLM處理的肺上皮細胞與轉染了oe-Fcnb的AMs衍生的外泌體共培養后，Fcn B的mRNA表達有更明顯的增加。用si-Fcnb轉染肺上皮細胞并用BLM處理后，Fcn B的mRNA表達明顯受到抑制。然而，與轉染了oe-Fcnb并經BLM處理的AMs衍生的外泌體共同培養可逆轉這種效應（圖4F）。隨后的Western印跡結果顯示，轉染si-Fcnb可顯著下調BLM處理的肺上皮細胞中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達，并上調p62的表達。然而，與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共同培養卻得到了相反的結果（圖4G，H）。此外，生化檢測結果表明，與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共培養后，si-Fcnb對MDA和Fe²⁺濃度的抑制作用以及對BLM處理過的肺上皮細胞中GSH的促進作用被逆轉（圖4I）。同樣，與轉染oe-Fcnb 和BLM處理的AMs衍生外泌體共培養后，轉染si-Fcnb和BLM處理的肺上皮細胞的ROS水平和死亡率顯著增加（圖4J，K）。Western 印跡結果顯示，在 BLM 處理的肺上皮細胞中，si-Fcnb轉染可明顯促進 GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達，抑制NCOA4的表達。然而，當與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生的外泌體共同培養時，這一趨勢發生了逆轉（圖4L，M）。這些結果表明，BLM誘導的AMs 通過外泌體轉運的Fcn B介導了肺上皮細胞的自噬和鐵死亡。

圖4：由BLM誘導的AMs轉運的Fcn B外泌體有助于肺上皮細胞自噬和鐵死亡

5.BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING通路促進肺上皮細胞自噬和鐵死亡

       當用BLM誘導si-Fcnb或si-cGAS轉染的肺上皮細胞時，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達下調，STING的磷酸化也降低，而p62的表達上調。然而，當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共同培養時，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達上調，STING的磷酸化也增加，而p62的表達下調（圖5A-C）。進一步研究發現，BLM誘導后，si-Fcnb或si-cGAS轉染的肺上皮細胞中MDA和Fe²⁺的水平降低，而GSH的水平升高。然而，將轉染oe-Fcnb的AMs與BLM誘導的AMs共同培養后，MDA和Fe²⁺的水平升高，而GSH的水平則相反（圖5D，E）。同樣，當轉染了si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細胞被BLM誘導時，ROS水平和細胞死亡率均下降。相反，當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共同培養時，ROS水平和細胞死亡率均升高（圖5F，G）。鐵死亡相關蛋白的檢測發現，當轉染si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細胞被BLM誘導時，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達上調，NCOA4的表達下調。不幸的是，當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共培養時，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達下調，而NCOA4的表達上調（圖5H，I）。這些結果表明，BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B促進了cGAS-STING通路介導的肺上皮細胞自噬和鐵死亡。

圖5：cGAS-STING通路介導的肺上皮細胞自噬和鐵死亡，由BLM誘導的AMs外泌體的Fcn B促進

6.BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING途徑促進的肺上皮細胞鐵死亡是自噬依賴性的

       為進一步闡明肺上皮細胞鐵死亡與自噬的關系，將si-cGAS轉染和 BLM誘導的肺上皮細胞與不同AMs的外泌體共同培養，并結合自噬抑制劑3-MA進行研究。si-cGAS轉染的肺上皮細胞和BLM誘導的肺上皮細胞的線粒體損傷均有所減輕。當它們與轉染oe-Fcnb和BLM處理過的AMs外泌體共同培養時，線粒體損傷加劇。然而，使用3-MA逆轉了oe-Fcnb轉染對細胞造成的損傷，細胞中的大多數線粒體保持正常狀態（圖6A）。此外，3-MA還降低了BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B對si-cGAS轉染細胞和BLM誘導的肺上皮細胞的自噬促進作用，表現出 LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7表達減少，p62表達增加（圖6B）。接著，轉染oe-Fcnb和BLM處理的AMs外泌體促進了si-cGAS轉染和BLM處理的肺上皮細胞中MDA和Fe²⁺的積累，并抑制了GSH的合成，而添加3-MA則顯示出相反的效果（圖6C，D）。此外，si-cGAS轉染和BLM處理的肺上皮細胞與oe-Fcnb轉染和BLM處理的AMs外泌體共培養后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達下調，NCOA4的表達上調，但這些變化在3-MA條件下相反（圖6G，H）。這些結果表明，抑制自噬可通過cGAS-STING 通路減輕BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B促進的肺上皮細胞鐵死亡。

圖6：抑制自噬可通過cGAS-STING通路減輕BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B 促進的肺上皮細胞鐵死亡

7.在BLM誘導的小鼠模型中，從AMs外泌體轉運的Fcn B通過鐵死亡促進肺損傷和纖維化

       為了研究AMs外泌體衍生的Fcn B在體內的功能，WT和Fcnb-/-小鼠受到BLM刺激后，尾靜脈注射轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs外泌體進行干預。HE 染色顯示，與WT+BLM組相比，Fcnb-/-+BLM組的肺泡結構更完整，炎癥浸潤更少。然而，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺泡結構不完整，炎癥浸潤增加（圖7A）。Masson染色還顯示，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺間質纖維化增加（圖7B）。此外，我們還發現Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組比Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組肺組織BALF總蛋白濃度增加、羥脯氨酸和α-SMA表達增加（圖7C-E）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC 組相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺部組織中受損線粒體數量增加（圖8A）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達明顯上調，p62的表達明顯下調（圖8B）。生化檢測顯示，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織和血清中MDA和Fe²⁺濃度顯著升高，而GSH濃度降低（圖8C，D）。流式細胞術顯示，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中的ROS水平高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組（圖8E）。此外，與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達顯著下調，而NCOA4的表達上調（圖8F，G）。此外，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組中cGAS的表達和STING的磷酸化明顯高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組（圖8H）。這些結果表明，在BLM誘導的小鼠模型中，從AMs外泌體轉運的Fcn B通過鐵死亡促進了肺損傷和肺纖維化。

圖7：AMs外泌體轉運的Fcn B有助于BLM誘導的小鼠模型的肺損傷和肺纖維化

圖8：AMs外泌體轉運的Fcn B促進了BLM誘導的小鼠的鐵死亡

結論
       總之，這是第一篇研究Fcn B在BLM誘導的肺損傷中的作用的報道，它表明由AMs外泌體轉運的Fcn B可通過cGAS-STING途徑促進肺上皮細胞鐵凋亡，從而加重BLM誘導的肺損傷（圖9）。

圖9

參考文獻
Wu, X., Jiang, Y., Li, R. et al. Ficolin B secreted by alveolar macrophage exosomes exacerbates bleomycin-induced lung injury via ferroptosis through the cGAS-STING signaling pathway. Cell Death Dis 14, 577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06104-4
常規分子實驗
外泌體的提取和鑒定、HE染色、Masson染色、生化檢測、蛋白質印跡檢測、RT-qPCR
細胞實驗
細胞培養和處理、流式細胞術
動物模型及病理實驗
BLM誘導肺損傷模型的構建與干預

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