tRNA來(lái)源的小RNA（tsRNAs）是壓力應(yīng)激的產(chǎn)物，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)和損傷調(diào)節(jié)有相當(dāng)大的影響。然而，tsRNAs是否可以改善肝損傷仍不清楚。在這里，本研究證實(shí)tsRNA可改善肝損傷通過(guò)利用NSun2的缺失作為tsRNAs發(fā)生模型。機(jī)制上，NSun2的缺失降低了tRNAs的m⁵U修飾和m⁵C修飾，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的tsRNAs，特別是tRF-1s類。通過(guò)進(jìn)一步篩選，作者發(fā)現(xiàn)tRF-Gln-CTG-026（tG026）是最佳的tRF-1，它通過(guò)削弱TSR1（pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物）與pre-40S核糖體之間的關(guān)聯(lián)，抑制全局蛋白合成，從而改善肝損傷。本文于2023年4月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》IF:39.3期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、在體外構(gòu)建loss-of-NSun2作為tsRNA發(fā)生模型以緩解損傷
       首先對(duì)小鼠進(jìn)行肝損傷誘導(dǎo)，驗(yàn)證tsRNAs是否參與肝損傷和修復(fù)（圖1a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝損傷小鼠中tsRNA的數(shù)量增加（圖1b），表明tsRNA的產(chǎn)生與肝損傷有關(guān)。為進(jìn)一步研究tsRNA與肝損傷的關(guān)系，建立tsRNA生成模型。通過(guò)篩選HL-7702細(xì)胞系中的三種tRNA修飾酶（NSun2、Mettl1和Dnmt2），在低損傷脅迫下，與ME-KD（Mettl1敲低）和DN-KD（Dnmt2敲低）相比，NSun2敲低（NS-KD）可導(dǎo)致增殖增加（圖1c, e）；此外，在高（致死）應(yīng)激下，NSun2敲低可提高細(xì)胞存活率（圖1d, e）。NS-KD也增加了H₂O₂處理下的細(xì)胞增殖（圖1f）。相反，使用不同的高強(qiáng)度應(yīng)激誘導(dǎo)劑（CCl4、對(duì)乙酰氨基酚和油酸混合物）并測(cè)量細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，NS-KD提高了應(yīng)激損傷下的細(xì)胞存活率(圖1g, i)。正如預(yù)期的，NS-KD僅在壓力下起作用，在基礎(chǔ)條件下，NS-KD不影響細(xì)胞增殖（圖1h, i）。總之，這些結(jié)果表明，肝損傷與tsRNA的產(chǎn)生有關(guān)，NS-KD可促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，但不會(huì)改變體外壓力下的細(xì)胞遷移。

圖1 NS-KD改善細(xì)胞損傷。

2、NS-KD在體內(nèi)改善肝損傷
       如上所述，NSun2的缺失是研究tsRNAs的一個(gè)合適模型，可以改善細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活。因此，作者通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的NSun2基因第2外顯子56 bp的缺失，產(chǎn)生了NS-KO小鼠（圖2a）。在沒有應(yīng)激損傷的情況下，NS-KO沒有引起肝臟形態(tài)學(xué)和病理生理的異常（圖2b），這表明NS-KO和由此產(chǎn)生的tsRNAs在沒有應(yīng)激的情況下都沒有功能。通過(guò)腹腔注射(i.p) CCl4模擬短期或長(zhǎng)期肝損傷（圖2c），證明NS-KO對(duì)應(yīng)激損傷和肝損傷有反應(yīng)。單次注射CCl4后第3天，肝臟出現(xiàn)壞死和炎癥；第27天，觀察到纖維化；NS-KO小鼠的壞死程度低于野生型小鼠（圖2d）。隨后檢測(cè)了單次或多次注射CCl4后的血液生化指標(biāo)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）濃度在單次注射CCl4后第3天達(dá)到最大值，表明肝細(xì)胞損傷相當(dāng)嚴(yán)重，隨后在重復(fù)注射CCl4后第27天降至相對(duì)正常水平；NS-KO小鼠的3項(xiàng)指標(biāo)均低于WT小鼠，提示NS-KO小鼠肝損傷輕微（圖2e, f）。此外，與WT小鼠相比，NS-KO小鼠在肝損傷第3天增殖肝細(xì)胞數(shù)量明顯增加（圖2g）；相反，NS-KO小鼠的干細(xì)胞凋亡顯著下降（圖2h）。在應(yīng)激狀態(tài)下，促增殖、促生存和抗炎相關(guān)基因的表達(dá)增加，而抗增殖、抗生存和抗炎相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制（圖2i）。總之，在短期和長(zhǎng)期肝損傷中，觀察到NS-KO小鼠的肝損傷比WT小鼠輕，表明NSun2缺失可減輕體內(nèi)肝損傷。

圖2 NS-KO改善肝壞死、再生和活體存活

3、NS-KO衍生的小RNA可改善應(yīng)激下的增殖和存活
       作者假設(shè)，NS-KO可通過(guò)NS-KO衍生的小RNA防止肝損傷。為驗(yàn)證這一假設(shè)，首先敲除HL-7702細(xì)胞系中的NSun2，將沒有酶活性的突變體NSun2（K190M或C271A）轉(zhuǎn)染到HL-7702細(xì)胞系中，并細(xì)胞毒性刺激。EdU和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，只有WT NSun2能抑制NSun2敲除引起的細(xì)胞增殖促進(jìn)（圖3a、b、d），而NSun2突變體（K190M或C271A）不能。同樣，只有WT NSun2 能逆轉(zhuǎn)NS-KD引起的細(xì)胞活力增加，而NSun2突變體則不能（圖3c, d）。這些結(jié)果表明，NSun2的缺失主要通過(guò)tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的喪失來(lái)促進(jìn)細(xì)胞在脅迫下的增殖和存活。在NS-KO細(xì)胞中，tRNA表達(dá)降低(圖3e)。變異最顯著的修飾是tRNA m5U和之前描述的m5C，在NS-KO樣本中，兩者都顯著降低（圖3f, g）。
       上述發(fā)現(xiàn)表明，NS-KO通過(guò)失去其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，同時(shí)減少tRNA m5U和m5C修飾來(lái)發(fā)揮作用。隨后研究NS-KO衍生的小RNA是否足以改善細(xì)胞在壓力下的增殖和存活。從WT和NS-KO小鼠體內(nèi)分離出14-50 nt和50-100 nt的肝臟RNA片段（圖3h）。由于tsRNAs的大小通常小于50 nt，所以將14-50 nt的RNA視為含tsRNAs的RNA，將50 - 100 nt的RNA視為非tsRNAs和陰性對(duì)照。EdU表明，轉(zhuǎn)染NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T小鼠的片段更能促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖3i），而50 - 100 nt的RNA不改變兩組的增殖。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，來(lái)自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段，而不是來(lái)自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和來(lái)自兩種小鼠的50-100 nt RNA片段，增加損傷后的細(xì)胞存活率（圖3j）。因此，NS-KO來(lái)源的14-50 nt RNA片段在促進(jìn)損傷后細(xì)胞增殖和存活方面發(fā)揮了重要作用。

圖3 NS-KO衍生的tsRNAs減輕肝損傷

4、tRF-1是NS-KO的核心產(chǎn)物
       為全面分析tsRNAs的代謝特征，分析WT和NS-KO小鼠不同應(yīng)激損傷后tsRNAs的差異，tsRNA-seq鑒定到841個(gè)未記錄的tsRNA和104個(gè)記錄在tRFdb數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知tsRNA（圖4a）。NS-KO小鼠的tsRNAs在整個(gè)損傷過(guò)程中保持相對(duì)較高的水平，而tsRNAs在WT D3時(shí)達(dá)到峰值（圖4b）。因此，作者猜想在整個(gè)CCl4重復(fù)注射過(guò)程中，第3天是肝細(xì)胞增殖和tsRNA生成最活躍的時(shí)間（圖2g, 4b），NS-KO小鼠可能具有與WT D3小鼠相似的“促修復(fù)tsRNA模式”。
       在進(jìn)一步分析WT和NS-KO小鼠肝損傷不同階段的tsRNAs圖譜后，發(fā)現(xiàn)與其他tsRNAs相比，NS-KO小鼠的tRF-1s突然增加。在所有肝損傷時(shí)間點(diǎn)，NS-KO組的tRF-1s都明顯多于WT組，但WT組只在第3天有所增加（圖4c，d）。對(duì)tRF-1s的詳細(xì)分析顯示，tRF-1s的長(zhǎng)度主要在14到23 nt之間（圖4d）。總的來(lái)說(shuō)，NSun2缺失主要在肝臟中產(chǎn)生14-23 nt的tRF-1s。此外，NS-KO小鼠的tRF-1表達(dá)高于WT小鼠，而其他類型的tsRNAs在NS-KO小鼠中的表達(dá)低于WT小鼠（圖1e）。總之，tRF-1是NS-KO阻止肝損傷和響應(yīng)壓力應(yīng)激的核心產(chǎn)物。

圖4 tsRNA-seq顯示應(yīng)激條件下WT和NS-KO小鼠中tRF-1的特征

5、篩選的tRF-1在體外和體內(nèi)對(duì)肝損傷有拯救作用
       如上所述，肝損傷的副產(chǎn)物主要是tRF-1s。為闡明tRF-1s是否可以作為治療肝損傷的一種潛在方法，人工合成了圖4所示的68個(gè)tRF-1s。用硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲基（2'-OMe）和膽固醇修飾tRF-1s，以提高其穩(wěn)定性和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率（圖5a）。然后，將人工合成的 tRF-1s 轉(zhuǎn)染到HL-7702細(xì)胞和原代人類肝細(xì)胞（PHH）中，并在體外和體內(nèi)驗(yàn)證它們的功能。EdU試驗(yàn)表明，合成的tRF-1s能促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖5b）。CCK-8檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)tRF-1s后細(xì)胞活力提高（圖5c）。在PHH中，也得到了一致的結(jié)果（圖5d，e）。為驗(yàn)證改良合成的tRF-1s在體內(nèi)的功能，給肝損傷小鼠靜脈注射tRF-1s。首先，選擇了一種tRF-1（tRF-Met-CAT-049）來(lái)測(cè)定小RNA在體內(nèi)的代謝時(shí)間過(guò)程。結(jié)果顯示，tRF-Met-CAT-049在注射后第1天開始表達(dá)，第3天達(dá)到峰值。因此，只注射一次tsRNAs就治愈了肝損傷小鼠（圖5f-i），因?yàn)樽⑸涞腞NAs可以在這段時(shí)間內(nèi)保持高水平表達(dá)。之后，進(jìn)一步從68個(gè)潛在的tRF-1中篩選出最有效的tRF-1。作者發(fā)現(xiàn)，篩選到的tG026在體內(nèi)可以改善肝損傷（圖5j, k），NS-KO后tG026的表達(dá)增加（圖5l, m）。綜上所述，通過(guò)篩選，tG026可以改善上述肝損傷。

圖5篩選的tG026促進(jìn)了損傷后細(xì)胞的增殖和存活

6、tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低全局蛋白質(zhì)合成
       為探索tG026的潛在機(jī)制，進(jìn)行RNA pull-down-LC-MS/MS檢測(cè)，以篩選與tG026相互作用的蛋白質(zhì)（圖6a）。在尋找HL-7702和AML12細(xì)胞系中與tG026 相互作用的共同蛋白后（圖6b），選擇參與Pre-40S核糖體組裝的前rRNA處理蛋白TSR1同源物（TSR1）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。作者推測(cè)tG026可能會(huì)調(diào)控核糖體。通過(guò)RNA pull-down，驗(yàn)證了TSR1和tG026在兩種細(xì)胞系中的相互作用（圖6c，d）。tG026抑制TSR1與核糖體之間的相互作用，因?yàn)?8S rRNA是核糖體復(fù)合物的重要組成部分（圖6e, f）。最后，OP-Puro incorporation 實(shí)驗(yàn)證實(shí)tG026抑制全局蛋白質(zhì)合成（圖6g, h）。

圖6 tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低GPS

       總而言之，缺失NSun2可減輕注射CCl₄對(duì)肝臟造成的損傷。機(jī)制上，NSun2 的缺失會(huì)減少m5U和m5C的修飾。因此，tRNA變得不穩(wěn)定并產(chǎn)生tsRNA，尤其是tRF-1。通過(guò)進(jìn)一步篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)tG026通過(guò)與TSR1相互作用，抑制了TSR1與18S rRNA之間的關(guān)聯(lián)，從而減少了全局蛋白質(zhì)合成，減輕肝損傷。

圖7 tG026參與肝損傷的機(jī)制模型。

實(shí)驗(yàn)方法
肺損傷小鼠建模，轉(zhuǎn)染，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，WB，劃痕實(shí)驗(yàn)，HE染色，免疫熒光，免疫組化，qRT-PCR，天狼星紅染色，LC-MS檢測(cè)tRNA修飾，small RNA測(cè)序，人工合成tsRNA和體內(nèi)注射，肝部分切除術(shù)（PH），RNA pull-down，蛋白組學(xué)分析，RIP，體外和體內(nèi)檢測(cè)蛋白總體水平
參考文獻(xiàn)
Ying S, Li P, Wang J, Chen K, Zou Y, Dai M, Xu K, Feng G, Zhang C, Jiang H, Li W, Zhang Y, Zhou Q. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct Target Ther. 2023 Apr 3;8(1):144. doi: 10.1038/s41392-023-01351-5. PMID: 37015921; PMCID: PMC10073094.