??

       逃避抗腫瘤免疫是癌癥的標(biāo)志。STING是公認(rèn)的固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭，通過協(xié)調(diào)髓系細(xì)胞的固有感知和適應(yīng)性免疫監(jiān)視，在增強(qiáng)抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。STING在多種人類惡性腫瘤中顯著沉默，并作為細(xì)胞內(nèi)在的腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。然而，STING如何發(fā)揮內(nèi)在抗腫瘤活性尚不清楚。本研究中作者發(fā)現(xiàn)STING限制有氧糖酵解，而不依賴于其固有免疫功能。機(jī)制上，STING靶向己糖激酶II（HK2），阻斷其己糖激酶活性。因此，STING通過抑制HK2抑制腫瘤有氧糖酵解，促進(jìn)體內(nèi)抗腫瘤免疫。該研究于2023年7月發(fā)表在《Nature Cell Biology》，IF：21.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. STING抑制有氧糖酵解
       在研究STING的功能時，作者發(fā)現(xiàn)，與野生型（WT）細(xì)胞相比，STING缺失的L929細(xì)胞培養(yǎng)液變黃的速度要快得多。作者推測STING可能調(diào)節(jié)有氧糖酵解。敲除L929細(xì)胞中的STING（圖1a），發(fā)現(xiàn)與對照組相比，STING敲除細(xì)胞分泌的乳酸更多（圖1b）。用HT-DNA和單純皰疹病毒（HSV-1）感染細(xì)胞導(dǎo)致乳酸生成增加。值得注意的是，與對照組相比，STING缺失的L929細(xì)胞產(chǎn)生了更多的乳酸，但是HT-DNA刺激和HSV-1感染不能進(jìn)一步促進(jìn)乳酸生成（圖1c，d）。用HSV-1刺激人單核細(xì)胞系THP-1，證實(shí)HSV-1感染后乳酸生成增加（圖1e）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，作者進(jìn)行了STING的挽救實(shí)驗(yàn)（圖1f），發(fā)現(xiàn)抑制了乳酸產(chǎn)生（圖1g）。同樣，HT-DNA刺激或HSV-1感染細(xì)胞，導(dǎo)致重新表達(dá)STING的細(xì)胞中乳酸生成增加（圖1h，i）。這些數(shù)據(jù)都表明,STING抑制乳酸生產(chǎn)。Seahorse分析顯示，WT和STING缺失細(xì)胞的胞外酸化率（ECAR）相似。加入葡萄糖和寡霉素后，STING缺失細(xì)胞的ECAR提高（圖1j），表明STING缺失的L929細(xì)胞的糖酵解能力上調(diào)。又進(jìn)行STING挽救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)STING缺失細(xì)胞中STING的重建又抑制ECAR，再次證實(shí)STING抑制有氧糖酵解（圖1k）。這些數(shù)據(jù)表明STING抑制有氧糖酵解和乳酸生成。

圖1. STING抑制有氧糖酵解

2. STING獨(dú)立于其固有作用限制糖酵解
       在STING缺失的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染兩種明確定義的STING突變體（S366A和R238A），S366A突變會阻止IRF3的募集，而R238A突變會破壞cGAMP的結(jié)合（圖2a，d）。檢測細(xì)胞乳酸含量，發(fā)現(xiàn)S366A和R238A突變體的重新表達(dá)與WT STING一樣有效地抑制乳酸生成（圖2b，e），這個結(jié)果暗示STING的固有免疫功能對于其限制糖酵解活性來說不是必要的。HT-DNA刺激或HSV-1感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)S366A突變體細(xì)胞中乳酸產(chǎn)生增加（圖2c）。R238A突變由于破壞了cGAMP結(jié)合，因此HT-DNA刺激或HSV-1感染不能促進(jìn)STING（R238A）重建細(xì)胞的乳酸生成（圖2f）。這些數(shù)據(jù)表明，STING的固有免疫功能對于抑制糖酵解不是必要的。對敲除Cgas的L929細(xì)胞進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，用HT-DNA刺激或HSV-1感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乳酸產(chǎn)量增高（圖2h，i）。進(jìn)一步證明STING抑制有氧糖酵解獨(dú)立于其固有免疫功能。

圖2. STING獨(dú)立于其固有作用限制糖酵解

3. STING通過靶向HK2抑制有氧糖酵解
       為全面了解STING對代謝的影響，在L929細(xì)胞中敲除STING并進(jìn)行代謝組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)敲除STING導(dǎo)致糖酵解途徑出現(xiàn)顯著富集（圖3a）。并且，STING缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖酵解代謝物數(shù)量增加，包括果糖-6-磷酸、丙酮酸、果糖-1,6-二磷酸、甘油-3-磷酸（G3P）、磷酸二羥丙酮和乳酸（圖3b）。用同位素標(biāo)記的[U-13C]葡萄糖喂養(yǎng)對照和STING 1敲除的L929細(xì)胞，并監(jiān)測碳通量。發(fā)現(xiàn)STING缺失導(dǎo)致糖酵解中間產(chǎn)物的標(biāo)記增強(qiáng)（圖3c）。這些結(jié)果證實(shí)STING抑制糖酵解。進(jìn)行親和純化和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)STING結(jié)合蛋白中包括HK2，HK2在糖酵解過程中催化葡萄糖磷酸化產(chǎn)生葡萄糖6-磷酸的限速步驟（圖3d）。通過免疫共沉淀和WB證實(shí)HK2和STING能形成復(fù)合體（圖3e）。進(jìn)行體外GST pull-down,并通過考馬斯亮藍(lán)染色證明純化的STING與GST-HK2相關(guān)，而與GST無關(guān)，表明STING與HK2直接結(jié)合（圖3f）。使用鄰近連接實(shí)驗(yàn)（PLA）進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)源性STING和HK2之間密切相關(guān)（圖3g）。HK2通過n -末端線粒體結(jié)合基序與線粒體外膜結(jié)合，因此檢測STING敲除細(xì)胞中線粒體代己糖激酶HK活性，發(fā)現(xiàn)在STING敲除的細(xì)胞中HK活性顯著增加（圖3h）。在STING缺失細(xì)胞中表達(dá)STING或STING（S366A）或STING（R238A）突變體，發(fā)現(xiàn)有效抑制HK活性,表明STING抑制HK2活性獨(dú)立于它的先天免疫功能（圖3i）。此外，用HT-DNA刺激或HSV-1感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HK2活性顯著升高，而這些處理不能進(jìn)一步上調(diào)STING敲除細(xì)胞中的HK活性（圖3j，k）。這些數(shù)據(jù)表明STING與HK2相互作用并抑制HK2活性以限制有氧糖酵解。

圖3. STING通過靶向HK2抑制有氧糖酵解

4. STING抑制HK2的線粒體定位和活性
       HK2的激活需要其線粒體定位。假設(shè)位于ER的STING抑制HK2并促進(jìn)HK2從線粒體釋放。為驗(yàn)證這一假設(shè)，分離線粒體和細(xì)胞質(zhì)，發(fā)現(xiàn)STING的缺失確實(shí)導(dǎo)致HK2在線粒體中的分布增加和細(xì)胞質(zhì)中HK2的分布減少（圖4a）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在對照組細(xì)胞中約28%的HK2與線粒體相關(guān);相比之下，在STING缺失細(xì)胞中約63%的HK2顯示線粒體定位（圖4b）。這些結(jié)果表明STING損害HK2的線粒體定位。此外，野生型STING、STING（S366A）或STIN（R238A）的恢復(fù)擾亂HK2的線粒體定位，并增加細(xì)胞質(zhì)的HK2水平，表明抑制HK2的線粒體定位并不需要STING的固有免疫功能（圖4c）。HK2通過與電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1）的相互作用與線粒體外膜結(jié)合。免疫共沉淀觀察到HK2有效結(jié)合VDAC1。并且，STING的表達(dá)幾乎消除了HK2和VDAC1之間的相互作用，表明STING破壞HK2 - VDAC1的關(guān)聯(lián)，從而損害HK2的線粒體定位和活性（圖4d）。將ΔN（1-14）突變體和P2A突變體重新導(dǎo)入STING缺失細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)并沒有抑制HK2的活性，作為對照，野生型STING、P8A和I10A/P11A突變體均能有效抑制HK2活性（圖4f）。此外，在STING缺失細(xì)胞中重建WT STING、STING（P8A）或STING（I10A/ P11A）會損害HK2的線粒體定位，而STING（P2A）或STING（ΔN（1-14））的重新表達(dá)并未使HK2從線粒體室分離到細(xì)胞質(zhì)部分（圖4g）。這些數(shù)據(jù)表明STING的P2與HK2結(jié)合阻斷HK2的線粒體定位和活性。

圖4. STING抑制HK2的線粒體定位和活性

5. STING靶向HK2促進(jìn)體內(nèi)抗腫瘤免疫
       STING是否在體內(nèi)限制有氧糖酵解,作者轉(zhuǎn)向兩個廣泛使用的MC38和CT26結(jié)直腸癌同系小鼠腫瘤模型。在MC38細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)STING可顯著下調(diào)乳酸生成（圖5a）。在MC38腫瘤模型中，STING的引入顯著減緩腫瘤的生長（圖5b，c），并下調(diào)腫瘤中乳酸的生成（圖5d）。作者還發(fā)現(xiàn)在表達(dá)STING的腫瘤中，腫瘤浸潤的CD8⁺T細(xì)胞的百分比增強(qiáng)，此外，在表達(dá)STING的MC38腫瘤中，約5%的CD8⁺T細(xì)胞為PD1和TIM3雙陽性，而對照組中約為16%，表明T細(xì)胞群嚴(yán)重耗竭（圖5e）。在嚴(yán)重免疫缺失且無法產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)的NSG小鼠中進(jìn)行了MC38腫瘤形成實(shí)驗(yàn)。STING表達(dá)并未抑制腫瘤生長（圖5f，g），但在表達(dá)STING的腫瘤中，乳酸生成減少（圖5h）。這些數(shù)據(jù)表明STING的免疫調(diào)節(jié)功能是其抗腫瘤活性的核心。在CT26細(xì)胞中敲除STING，乳酸的產(chǎn)生增加約20%（圖5i，j）。并且STING缺失導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷增加，腫瘤提取物中的乳酸增加（圖5k，l）。與對照組相比，在STING缺失的腫瘤中，腫瘤內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞的豐度降低，而嚴(yán)重耗竭的CD8⁺T細(xì)胞群增加（圖5m），表明STING缺失抑制抗腫瘤免疫。這些數(shù)據(jù)表明，STING在體內(nèi)限制有氧糖酵解并增強(qiáng)抗腫瘤免疫。接下來，作者試圖在體內(nèi)建立STING對HK2的限制和STING的內(nèi)在腫瘤抑制活性之間的因果關(guān)系。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者轉(zhuǎn)向兩個不能結(jié)合并抑制HK2的STING突變體（ΔN（1-14）和P2A）。在MC38腫瘤模型中，WT STING延遲腫瘤的生長，而ΔN（1-14）和P2A突變沒有延遲（圖5n-p）。一致，ΔN（1 - 14）和P2A STING突變體失去MC38腫瘤中抑制乳酸生產(chǎn)的能力（圖5q）。與WT STING相比，ΔN（1-14）和P2A突變沒有增加腫瘤中淋巴細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞的浸潤（圖5r）。這些數(shù)據(jù)表明STING靶向HK2抑制有氧糖酵解從而促進(jìn)抗腫瘤免疫。

圖5. STING靶向HK2促進(jìn)體內(nèi)抗腫瘤免疫

6. STING在已確診的腫瘤中限制有氧糖酵解
       構(gòu)建MC38穩(wěn)定細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠表達(dá)多西環(huán)素誘導(dǎo)的STING（圖6a）。將細(xì)胞移植到C57BL/6J小鼠皮下（n = 6）。植入后第8天，當(dāng)腫瘤新生血管形成時，開始誘導(dǎo)STING表達(dá)。結(jié)果表明STING誘導(dǎo)表達(dá)顯著抑制腫瘤生長,減少乳酸生產(chǎn)（圖6b，c）。此外,STING誘導(dǎo)表達(dá)促進(jìn)淋巴細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞的浸潤（圖6d，e）。相比而言，STING（ΔN（1-14））和STING（P2A）突變體的誘導(dǎo)表達(dá)（圖6f）并未抑制腫瘤生長，減少乳酸生成或促進(jìn)抗腫瘤免疫（圖6g-i）。為證實(shí)這些結(jié)果，構(gòu)建CT26穩(wěn)定細(xì)胞系，該細(xì)胞系可實(shí)現(xiàn)多西環(huán)素誘導(dǎo)的STING敲低（圖6j）。對葡萄糖進(jìn)行同位素標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)糖酵解中間體的同位素標(biāo)記增強(qiáng)（圖6l），腫瘤生長增強(qiáng)（圖6k）。這些數(shù)據(jù)表明，在已建立的腫瘤中，STING限制有氧糖酵解以促進(jìn)抗腫瘤免疫。

圖6. STING在已確診的腫瘤中限制有氧糖酵解

7. HK2是STING腫瘤抑制活性所必需的
       耗盡HK2，如預(yù)期Hk2缺失大大降低乳酸分泌（圖7a，b）。并且，與對照細(xì)胞相比，敲除STING不能增強(qiáng)HK2缺失細(xì)胞的乳酸生成，這表明STING限制依賴于HK2的糖酵解（圖7c，d）。在CT26細(xì)胞中敲除STING，導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷增強(qiáng)和乳酸水平升高，而敲除HK2延遲腫瘤生長并顯著下調(diào)腫瘤中的乳酸水平。表明HK2基因敲除抑制STING基因敲除帶來的的糖酵解和促腫瘤活性（圖7e-h）。此外，STING的缺失降低腫瘤內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞的豐度，敲除HK2時，STING的免疫調(diào)節(jié)作用消失（圖7i）。在這些組中，腫瘤內(nèi)CD4⁺T細(xì)胞的分布沒有顯著變化（圖7j）。這些數(shù)據(jù)表明，HK2對細(xì)胞內(nèi)在的糖酵解限制和STING的腫瘤抑制活性是必需的。

圖7. HK2是STING腫瘤抑制活性所必需的

8. STING調(diào)節(jié)人結(jié)直腸癌中的有氧糖酵解 
       為證實(shí)研究結(jié)果與臨床相關(guān)性，作者分析了一組人類結(jié)直腸癌（CRC）樣本。免疫組化和HE染色表明，與STING低表達(dá)的樣本相比，STING高表達(dá)的樣本顯示出更高的T細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞浸潤（圖8a）。并且發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌樣本中STING的表達(dá)與乳酸水平呈顯著負(fù)相關(guān)，乳酸與CD8⁺T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)，STING表達(dá)與CD8⁺T細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)（圖8b）。這些結(jié)果與STING在限制有氧糖酵解和促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)方面的作用一致。
9. SNV（單核苷酸位點(diǎn)變異）STING（P2S）不能限制糖酵解
       作者研究了天然存在的STING（P2S）突變體對糖酵解的影響。發(fā)現(xiàn)P2S突變體不能與HK2結(jié)合，在STING敲除的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染P2S，也不能抑制乳酸活性和HK活性（圖8c-f）。在STING敲除細(xì)胞中轉(zhuǎn)染P2S也不能將HK2從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中（圖8g）。這些數(shù)據(jù)表明，天然存在的STING（P2S）突變失去靶向HK2和限制糖酵解的能力。

圖8. 人結(jié)直腸癌中的乳酸水平與STING的表達(dá)和抗腫瘤免疫呈負(fù)相關(guān)，并且天然存在的STING（P2S）SNV失去限制HK2和糖酵解的能力 

結(jié)論
       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，STING具有獨(dú)立于其天然免疫功能的新功能，即作為細(xì)胞內(nèi)在代謝檢查點(diǎn)，通過靶向HK2阻斷其己糖激酶活性，從而限制腫瘤的有氧糖酵解，促進(jìn)體內(nèi)抗腫瘤免疫。這一發(fā)現(xiàn)對開發(fā)基于STING的療法來改善抗腫瘤免疫治療具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)方法
小鼠培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒和載體構(gòu)建，免疫沉淀和免疫印跡，小鼠腫瘤單細(xì)胞懸液的制備，流式細(xì)胞術(shù)，代謝組學(xué)和同位素示蹤代謝組學(xué)，ECAR的測定，HK活性測定，乳酸測定，蛋白純化，體外HK酶活性測定，GST pull-down實(shí)驗(yàn)，RNA提取和RT-qPCR，RNA-seq，熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)，免疫熒光染色，PLA分析，免疫組化
參考文獻(xiàn)
Zhang L, Jiang C, Zhong Y, Sun K, Jing H, Song J, Xie J, Zhou Y, Tian M, Zhang C, Sun X, Wang S, Cheng X, Zhang Y, Wei W, Li X, Fu B, Feng P, Wu B, Shu HB, Zhang J. STING is a cell-intrinsic metabolic checkpoint restricting aerobic glycolysis by targeting HK2. Nat Cell Biol. 2023 Aug;25(8):1208-1222. doi: 10.1038/s41556-023-01185-x. Epub 2023 Jul 13. PMID: 37443289.

??