前列腺癌（PC）的骨轉(zhuǎn)移頻率最高，且對¹⁷⁷Lu-前列腺特異性膜抗原（PSMA）放射性配體療法的耐藥性很強(qiáng)。目前人們對骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPCa）對放射治療的耐藥性知之甚少。該研究發(fā)現(xiàn)骨特異性m6A修飾的增強(qiáng)子RNA（eRNA）在調(diào)控mPCa進(jìn)展和放療抵抗中發(fā)揮重要作用。本文于2023年1月發(fā)表在《Theranostics》IF：12.4期刊。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、在骨mPCa中鑒定特異性eRNA修飾
       作者比較了有無化療的患者之間的存活情況以探究化療抵抗和骨mPCa患者之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMA放療延長原發(fā)PCa患者和淋巴結(jié)（LN）mPCa的存活時(shí)間，但是對骨mPCa的作用有限（附圖1A）。鑒于增強(qiáng)子和eRNA是組織特異性和功能特異性的元件，作者探索了骨mPCa中的特異性eRNA，并表征了表觀轉(zhuǎn)錄組的骨mPCa相關(guān)功能。在CRPC細(xì)胞中通過RNA-seq鑒定的100個(gè)差異上調(diào)的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄本中，發(fā)現(xiàn)43個(gè)eRNA在骨mPCa PC3細(xì)胞中高表達(dá)（圖1A）。作者此前檢測m6A是否是致癌骨mPCa中eRNA的特異性修飾，發(fā)現(xiàn)通過兩種不同的m6A抗體結(jié)合MeRIP-seq免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)6個(gè)帶有m6A信號的eRNA。隨后，通過基因間峰選擇和qPCR驗(yàn)證篩選6個(gè)eRNA，結(jié)果在骨mPCa細(xì)胞中有一個(gè)獨(dú)特的m6A eRNA上調(diào)（圖1A-B）。對LNCaP和PC3細(xì)胞已發(fā)表的ChIP-seq數(shù)據(jù)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域是一個(gè)真正的增強(qiáng)子，表現(xiàn)為可富集增強(qiáng)子激活子（BRD4）、增強(qiáng)子標(biāo)記物（H3K4me1和H3K27ac）和啟動(dòng)子標(biāo)記物（H3K4me3）（圖1B）。根據(jù)eRNA的命名規(guī)則，作者將該eRNA標(biāo)記為MLXIPe，因?yàn)樗cMLXIP mRNA接近。兩個(gè)推測的m6A位點(diǎn)(#1:TTACA chr12 122502280-122502284;#2: GGACA chr12 122506423-122506427)在MLXIPe中被兩個(gè)獨(dú)立的m6A抗體鑒定（圖1B）。

附圖1 MLXIPe的m6A是患者的不良預(yù)后因素

       從原發(fā)性前列腺癌、鄰近正常前列腺組織和骨轉(zhuǎn)移癌的新鮮樣本中收集了m6A抗體免疫沉淀的RNA，以證明m6A修飾在臨床病理背景下的功能作用。箱形圖顯示，在該隊(duì)列中，骨mPCa樣本中MLXIPe的#2-m6A水平明顯高于原發(fā)性PCa或鄰近前列腺樣本（圖1C-D）。然而，在mPCa、原發(fā)性PCa和鄰近前列腺正常組織樣本之間，MLXIPe的#1-m6A水平無顯著差異（附圖1B）。此外，發(fā)現(xiàn)MLXIPe的#2-m6A水平在骨mPCa細(xì)胞系PC3和C4-2B中顯著升高（附圖1C-D），但MLXIPe的#1-m6A水平在所有細(xì)胞系中沒有差異（附圖1E）。在骨轉(zhuǎn)移隊(duì)列中，進(jìn)一步確定MLXIPe #2-m6A水平與PCa患者臨床特征的生存意義。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，在骨mPCa患者中，MLXIPe的RNA和m6A水平升高與較短的生存期相關(guān)（圖1E-F）。PET分析顯示，在前列腺癌患者73 (P-73) ^{mlxipe - m6low}中，遠(yuǎn)端骨轉(zhuǎn)移腫瘤信號在放療后消失，但在P-90^{MLXIPe-m6Ahigh}中，脊柱兩側(cè)和骨盆均檢測到較強(qiáng)的信號（圖1G），提示MLXIPe-m6A^high患者存在放療耐藥。總而言之，MLXIPe的m6A修飾是骨mPCa所特異性的。

圖1 MLXIPe的m6A參與PC的轉(zhuǎn)移和化療

2、MLXIPe誘導(dǎo)的mPCa放療抵抗是通過上調(diào)PSMD9
       eRNA通過增加增強(qiáng)子-啟動(dòng)子環(huán)將增強(qiáng)子活性轉(zhuǎn)移到一個(gè)或幾個(gè)相鄰的目標(biāo)啟動(dòng)子上。為確定受MLXIPe增強(qiáng)子調(diào)控的下游啟動(dòng)子，使用類似于染色體構(gòu)象捕獲(3C)的策略研究了相鄰啟動(dòng)子，并使用捕獲Hi-C（cHi-C）技術(shù)分析了已發(fā)表的數(shù)據(jù)。通過cHi-C的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子環(huán)確定了MLXIPe周圍的11個(gè)mRNA（圖2A）。通過RNA-seq數(shù)據(jù)排除PCa細(xì)胞中無表達(dá)的4個(gè)mRNA，通過3C檢測確定了人骨- mPCa患者來源的異種移植(PDX)原代細(xì)胞系90 (P-90)中7個(gè)啟動(dòng)子的空間組織。3C數(shù)據(jù)顯示，利用反義寡脫氧核苷酸(ASOs)敲除MLXIPe會降低MLXIPe與WDR66、PSMD9、SETD1B和MLXIP位點(diǎn)之間的特異性增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用（圖2A）。在通過基因組DNA相互作用鑒定出MLXIPe靶基因后，研究MLXIPe是否影響它們的轉(zhuǎn)錄。用ASOs敲除MLXIPe，驗(yàn)證eRNA對靶蛋白表達(dá)的作用。利用3個(gè)獨(dú)立的ASOs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄qPCR和RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，MLXIPe下調(diào)骨- mPCa原代細(xì)胞系P-90和PC3細(xì)胞中這4個(gè)靶基因的表達(dá)（圖2B-C）。還發(fā)現(xiàn)PSMD9是一個(gè)特異性的骨- mPCa相關(guān)基因，但WDR66、SETD1B和MLXIP是致癌基因（圖2D）。較高水平的PSMD9與較低的放療后無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)（圖2E）。綜上所述，PSMD9作為MLXIPe骨特異性靶基因，與骨mPCa患者的放療耐藥和較短的生存期相關(guān)。

圖2 PSDM9是受到MLXIPe調(diào)控的靶基因并參與化療抵抗

3、MLXIPe通過m6A與KHSRP相互作用
       通過生成 CRISPR 對照（Ctrl）和 MLXIPe #2-m6A 位點(diǎn)缺失（-del）細(xì)胞系，用生物素標(biāo)記的探針靶向 MLXIPe eRNA 或 PSMD9 mRNA 進(jìn)行無偏串聯(lián)親和純化，從而探索了m6A在MLXIPe的分子機(jī)制。質(zhì)譜分析結(jié)果表明MLXIPe eRNA與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，包括對照（Ctrl）細(xì)胞中的循環(huán)蛋白 MED12和KH結(jié)構(gòu)域蛋白hnRNPK、IGF2BP2或KHSRP，但在MLXIPe -m6A-del細(xì)胞中與KH結(jié)構(gòu)域蛋白沒有結(jié)合（圖3A）。類似地，PSMD9 mRNA在Ctrl細(xì)胞中與幾種蛋白結(jié)合，包括翻譯蛋白eIF4A1、eIF4G2和KH結(jié)構(gòu)域蛋白KHSRP，但在eRNA-m6A-del 細(xì)胞中不與KH結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合（圖3A）。KHSRP是一種與多種癌癥有關(guān)的RNA結(jié)合蛋白，是兩組引物中的共同蛋白（圖3B）。我們敲除了KHSRP蛋白的四個(gè)結(jié)構(gòu)域（N-端、KH1/2、KH3/4或C-端缺失），以證實(shí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖 3C）。交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）-PCR檢測表明，KH1/2缺失結(jié)構(gòu)域阻斷了KHSRP蛋白與PSMD9 mRNA的相互作用（圖3D），KH3/4缺失結(jié)構(gòu)域顯著抑制了KHSRP與MLXIPe的相互作用（圖3E）。此后，作者進(jìn)一步證明KHSRP是m6A和m6Am的雙解讀器，通過KH1/2結(jié)構(gòu)域與m6Am相互作用，通過KH3/4結(jié)構(gòu)域與m6A相互作用（圖4A）。

圖3 KHSRP與eRNA和mRNA結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合物

4、KHSRP通過與eRNA連接來穩(wěn)定mRNA
       鑒于m6A可調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，所以作者檢測了P-90細(xì)胞中RNA的半衰期，以確認(rèn)m6Am與mRNA穩(wěn)定性的相關(guān)性。數(shù)據(jù)表明，2號m6A 缺失增加了PSMD9 mRNA降解，但在P-90和PC3胞中，1號-m6Am位點(diǎn)缺失未能完成降解（圖4B）。用兩個(gè)獨(dú)立的shRNA去掉KHSRP能顯著下調(diào)PSMD9 RNA水平并增強(qiáng)PSMD9 mRNA降解（圖4C-D）。據(jù)報(bào)道，m6Am的writer是PCIF1。PCIF1-KD損害了MLXIPe升高的PSMD9 RNA水平（圖4E）。XRN1和XRN2是高度過程性的5' > 3'外切核酸酶。基因敲除試驗(yàn)表明，XRN2而不是XRN1是負(fù)責(zé)PSMD9 mRNA 降解的5' > 3' 外切核酸酶（圖4F）。敲除KHSRP會增加PSMD9 mRNA與XRN2的結(jié)合（圖4G）。此外，敲除XRN2會提高PSMD9 mRNA的穩(wěn)定性（圖4H）。這些數(shù)據(jù)表明，MLXIPe-KHSRP-PSMD9阻斷了骨 mPCa細(xì)胞中XRN2誘導(dǎo)的PSMD9 mRNA降解（圖4I）。

圖4 eRNA-KHSPR-mRNA復(fù)合物保護(hù)PSMD9 mRNA抵抗XRN2

5、MLXIPe通過m6A提高PCa細(xì)胞中DNA修復(fù)蛋白的水平
       文獻(xiàn)表明PSMD9是與乳腺癌細(xì)胞放療抗性相關(guān)的放療預(yù)測標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)，MLXIPe通過eRNA m6A介導(dǎo)PSMD9 mRNA的穩(wěn)定性并上調(diào)其蛋白水平（圖4）。作者從PDX隊(duì)列中選擇了4個(gè)MLXIPe m6A^high和MLXIP m6A^low的原發(fā)性骨-mPCa PDX細(xì)胞，以確定MLXIPe m6A是否是骨-mPCa中特異的放療耐藥性標(biāo)志物。不同劑量輻射曲線數(shù)據(jù)表明，MLXIPe m6A^high的細(xì)胞對放療具有抗性；然而，MLXIPe m6A^low的細(xì)胞則以劑量依賴的方式被輻射殺死（圖5A）。WB顯示，在MLXIPe m6A^high細(xì)胞中，ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平上調(diào)，但ATR的表達(dá)不受影響（圖5B）。
       作者敲除MLXIPe中的m6A，以進(jìn)一步證實(shí)m6A在DNA修復(fù)途徑中的功能。表達(dá)數(shù)據(jù)顯示，MLXIPe WT而非MLXIPe-m6A缺失會提高ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平（圖5C）。在MLXIPe m6A^low的P-73細(xì)胞和MLXIPe m6A^high的P-90細(xì)胞中驗(yàn)證了eRNA-KHSRP-mRNA復(fù)合物在DNA修復(fù)途徑中的功能。數(shù)據(jù)顯示，KHSRP的缺失抑制了MLXIPe對ATM、DNA-PKcs和p53蛋白的上調(diào)，并降低了MLXIPe m6A^low P-73細(xì)胞中γ-H2AX病灶的比例（圖5D）。同時(shí)，在MLXIPe m6A缺失的細(xì)胞中，XRN2敲除可挽救ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平，并提高γ-H2AX病灶的比率（圖5E）。這些數(shù)據(jù)表明，MLXIPe通過m6A和KHSRP復(fù)合物提高骨-mPCa細(xì)胞中的ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平。

圖5 MLXIPe上調(diào)DNA修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白

6、MLXIPe通過m6A和KHSRP增強(qiáng)前列腺PDX放療耐藥性
       通過編輯4個(gè)MLXIPe m6A^high PDX細(xì)胞中的m6A位點(diǎn)，測試MLXIPe的m6A在PDX細(xì)胞中的功能。數(shù)據(jù)顯示，在MLXIPe m6A位點(diǎn)缺失（-del）的mPCa細(xì)胞中，放療抗性受損，放射敏感性恢復(fù)（圖6A-B）。接下來，在體內(nèi)異種移植模型中測定了MLXIPe的m6A功能，并考察了MLXIPe的m6A調(diào)控對前列腺異種移植生長和放射抗性的影響。將MLXIPe-m6A-del細(xì)胞注射到小鼠側(cè)腹，數(shù)據(jù)顯示MLXIPe-m6A敲除后，異種移植物的生長略有下降，而KHSRP-KD轉(zhuǎn)染則不影響異種移植物的生長（圖6C-D）。值得注意的是，MLXIPe-m6A-del組和KHSRP-KD組在放療36天后恢復(fù)放射敏感性，而Ctrl組沒有恢復(fù)（圖6D）。qPCR數(shù)據(jù)顯示，PSMD9 mRNA與異種移植物的放療抗性相關(guān)（圖6E-G）。因此，數(shù)據(jù)表明，MLXIPe或KHSRP的m6A可提高PDX模型中mPCa的放療耐受性。

圖6 在體內(nèi)MLXIPe誘導(dǎo)化療抵抗

       總之，本研究提供了有關(guān)mPCa RT抗性、eRNA修飾和潛在m6Am閱讀器機(jī)制的新見解。檢測到骨特異性eRNA與m6A，后者促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移前列腺PDXs的 放療抗性功能。KHSRP能識別eRNA上的m6A和mRNA 5'-UTR上的m6Am并與之相互作用，從而阻斷XRN2對5'-UTR上RNA的降解。研究結(jié)果表明，骨特異性eRNA-m6 在 mPCa生長和放療抗性方面至關(guān)重要，可能成為癌癥治療的新靶點(diǎn)（圖6）。我們的研究強(qiáng)調(diào)了MLXIPe是骨-mPCa的潛在預(yù)測性生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

圖像摘要

實(shí)驗(yàn)方法
臨床樣本收集，患者來源的異種移植（PDX），正電子發(fā)射斷層掃描（PET），小鼠異種移植瘤模型，生物素標(biāo)記的RNA pull down，WB，CRISPR)-Cas9，交聯(lián)免疫沉淀（CLIP），γ-H2AX染色
參考文獻(xiàn)
Zhao Y, Wen S, Li H, Pan CW, Wei Y, Huang T, Li Z, Yang Y, Fan S, Zhang Y. Enhancer RNA promotes resistance to radiotherapy in bone-metastatic prostate cancer by m6A modification. Theranostics. 2023 Jan 1;13(2):596-610. doi: 10.7150/thno.78687. PMID: 36632223; PMCID: PMC9830431.