肝癌在全球最常見的癌癥中排名第六，在癌癥相關死亡的主要原因中排名第三。肝細胞癌（HCC）占所有原發(fā)性肝癌的80%以上。HCC腫瘤由復雜的腫瘤微環(huán)境（TME）組成，包含細胞、化學和物理成分。TME對肝細胞癌的療效和預后具有重要意義。TME的成分被廣泛認為是實體腫瘤的關鍵決定因素，影響實體腫瘤的發(fā)生、生長和進展。闡明TME和癌癥之間的關系可以為識別新的HCC診斷標志物和開發(fā)治療策略提供有價值的見解。最近的研究在TME中檢測到微生物群的存在，腫瘤內(nèi)微生物可能通過多種方式影響癌癥的發(fā)生和進展。微生物群作為TME中的關鍵因素受到越來越多的關注。闡明微生物、TME和癌細胞之間復雜的相互作用可以為潛在的癌癥治療提供有價值的見解，并有助于在個體患者水平評估現(xiàn)有治療的有效性。近年來，對肝癌腫瘤內(nèi)微生物群的研究越來越多。Komiyam等利用16S rDNA測序確定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌組織中的微生物群特征。此外一項多組學研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)微生物群與代謝物和遺傳改變密切相關。因此，進一步研究HCC腫瘤微生物群的概況，明確其臨床意義和預后價值勢在必行。該研究發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》，IF：10.6。
技術路線

圖形摘要

主要研究結(jié)果
1. 人口學特征
       收集91例接受了納入/排除程序的患者樣本。中位年齡為55（35~83）歲，83例患者（91.2%）為男性。34例（37.4%）患者飲酒，73例（80.2%）患者感染HBV，15例（16.5%）患者合并2型糖尿病。62例（68.1%）患者被診斷為肝硬化；其中5例Child-Pugh分級為B級，其余57例Child-Pugh分級為a級。TNM分期I期45例（49.4%），II期19例（20.9%），III期27例（29.7%）。手術時無一例參與者發(fā)生淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤分化程度高（30.0%）、中（48.3%）和低（20.9%）。
2. 肝細胞癌中微生物群的存在
       為了揭示HCC中微生物群的存在，作者使用EUB388探針對腫瘤樣本進行了FISH。FISH信號檢測證實肝細胞癌中存在細菌（圖1A）。此外，微生物分布表現(xiàn)出一定的異質(zhì)性。作者通過FISH和免疫熒光共染色進一步探索了微生物存在和免疫細胞之間的關系。CD8+細胞中存在一些FISH信號，表明CD8+細胞內(nèi)存在細菌（圖1B）。CD68+巨噬細胞傾向于分布在腫瘤內(nèi)微生物群較豐富的區(qū)域（圖1C），提示腫瘤內(nèi)微生物群可能影響HCC中巨噬細胞的浸潤。

圖1 肝細胞癌中腫瘤內(nèi)微生物群的存在及其與免疫細胞的共生關系

3. 腫瘤和鄰近正常組織中的不同微生物譜
       對91例HCC患者的腫瘤和癌旁組織標本進行了檢測。α多樣性的Shannon指數(shù)顯示腫瘤和鄰近組織之間沒有顯著差異（p=0.436，圖2A）。利用曼哈頓距離（PCoA）計算的β多樣性揭示了腫瘤組和正常組之間的顯著差異（p<0.001，圖2B）。此外，偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）還揭示了兩組之間的多樣性（圖2C）。平均而言，4個細菌門（變形桿菌、放線菌、厚壁菌和異常球菌-棲熱菌）占據(jù)了90%的序列。這四個門在腫瘤和鄰近正常組織中均占主導地位（圖2D）。
       使用edgeR，在腫瘤和正常組織之間進行差異分析，以識別顯著失調(diào)的擴增子序列（ASV）。分析表明，在腫瘤組織中，15個ASV上調(diào)，22個下調(diào)（圖2E）。利用LEfSe方法鑒定有助于區(qū)分腫瘤和正常組織的類群。放線菌、變形桿菌、異常球菌-棲熱菌和厚壁菌可能解釋了兩組之間的差異。作者建立了一個隨機森林分類器，該分類器在區(qū)分腫瘤和鄰近組織方面取得了中等性能，準確率為73.2%。屬于上述四個門的屬在腫瘤和鄰近組織的預測中貢獻最大（圖2F）。
       最后，作者評估了腫瘤組和正常組分類群之間的相關性（圖2G）。作者觀察到兩組在網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和復雜度上存在明顯差異。在正常組中，厚壁菌、變形菌和奇球菌屬的ASV之間呈顯著正相關。在腫瘤組中，雖然變形桿菌和放線菌之間很少存在正相關，但腫瘤組中各菌群之間的相關性比鄰近組織中的少。

圖2 肝細胞癌腫瘤和鄰近正常組織中微生物群的特征

4. 個體間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性
       每個個體的微生物群成被繪制在門水平。如圖3A所示，HCC患者的微生物譜存在顯著差異。作者還確定了每例患者多個腫瘤病變之間的微生物異質(zhì)性（圖3B）。值得注意的是，樣本P103_tumor_2取自門靜脈的一個癌栓，表明在轉(zhuǎn)移過程中微生物譜發(fā)生了變化。

圖3 肝細胞癌中微生物群的個體或多個腫瘤病變之間的異質(zhì)性

5. 腫瘤內(nèi)微生物特征和臨床特征之間的相關性
       進一步分析患者的臨床特征（如飲酒、肝硬化、HBV感染、腫瘤分化程度和TNM分期）與微生物譜的關系。結(jié)果顯示，不同腫瘤分化程度（圖4A和B）或TNM分期（圖4C和D）之間的α和β多樣性沒有顯著差異。
       進一步分析上述ASV與HCC患者生化指標的關系。放線菌與總膽汁酸（TBA）水平降低相關。變形桿菌與總蛋白（TP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和TBA水平升高相關，這可能表明肝臟的病理生理狀態(tài)（圖4E）。

圖4 腫瘤內(nèi)微生物群與臨床特征的相關性

6. 腫瘤內(nèi)微生物群的肝型
       具有抗腫瘤和促進腫瘤作用的微生物可能同時存在于TME中。因此，關注單一微生物會忽略TME中微生物標簽的全面性。因此，為了全面了解腫瘤內(nèi)微生物群和疾病結(jié)局之間的關系，作者確定了兩個簇作為腫瘤內(nèi)微生物譜的“肝型”。
       作者根據(jù)HCC TME中門水平微生物標簽的層次聚類分析對A型和B型的標簽進行了分類（圖5A）。有趣的是，3例多發(fā)病灶患者的病灶被分為A型和B型，而另外5例多發(fā)病灶患者的所有病灶樣本都被分為A型或B型，而不是兩者都被分為A型或B型。肝B型的α-多樣性顯著高于肝A型（Shannon指數(shù)，p<0.001，圖5B）。兩個PCoA（圖5C）和PLS-DA（圖5D）表明兩種肝型的β多樣性顯著不同。
       作者進一步對肝型A和肝型B的微生物群落進行了網(wǎng)絡分析（圖5E）。作者發(fā)現(xiàn)了兩種肝型之間不同的網(wǎng)絡模式。肝A型表現(xiàn)出放線菌和變形桿菌微生物之間復雜的正相關關系，形成相互作用的模式。然而，僅在乙型肝炎中發(fā)現(xiàn)了一些正相關，表明微生物相互作用的模式相對分散。

圖5 兩種肝型微生物群的聚類分析和特征

7. 肝型對肝癌預后的影響
       對于3例多發(fā)病灶被分為不同肝型的患者，這些患者被認為是A型肝型，Kaplan-Meier分析顯示A型肝型預后不良（圖6A和B）。A型肝型患者的中位OS為65個月，而B型肝型患者的中位OS未達到（p=0.006）。在RFS方面也獲得了類似的結(jié)果，A型肝細胞癌患者的中位RFS為8個月，B型肝細胞癌患者為20個月（p=0.098）。進一步分析顯示，肝型與其他臨床特征（包括TNM分期、飲酒、肝硬化和HBV感染）無關（圖5A），這提示肝型的微生物聚集可能是獨立的預后因素。Cox回歸分析用于證明肝型以及其他重要預后因素的預測能力，包括腫瘤分化程度、腫瘤大小、大血管侵犯和腫瘤數(shù)量。結(jié)果驗證了肝型對OS（HR=0.296，95%CI：0.126-0.699，p=0.005）和RFS（HR=0.504，95%CI：0.276-0.918，p=0.025)的預測能力。

圖6 根據(jù)肝類型定義的肝細胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

結(jié)論
       該研究描述了肝癌TME中腫瘤內(nèi)微生物群的特征，并發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)微生物群的模式顯著影響肝癌患者術后的生存。因此，瘤內(nèi)微生物群可幫助預測患者結(jié)局，并且是每種肝型所特有的，表明預后良好的肝型可能有助于形成良好的TME和患者結(jié)局。

實驗方法
16S rDNA測序，熒光原位雜交（FISH），免疫熒光
參考文獻
Sun L, Ke X, Guan A, Jin B, Qu J, Wang Y, et al. Intratumoural microbiome can predict the prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1331. doi: 10.1002/ctm2.1331.