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       胸腺和脾臟與肝臟不同，是對(duì)輻射敏感的組織，在體內(nèi)全身輻射后會(huì)觸發(fā)p53依賴性凋亡。但這種肝臟特異性抗性的分子機(jī)制尚不清楚。作者通過(guò)對(duì)經(jīng)輻射處理的小鼠器官進(jìn)行RNA-seq和ChIP-seq聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)了共有的和組織特異的p53轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。胸腺和脾臟共有的p53靶點(diǎn)富含凋亡靶點(diǎn)。肝臟不能上調(diào)這些基因并不是由于基因占有率降低。p53的C末端缺失可使輻射誘導(dǎo)的p53凋亡靶點(diǎn)在肝臟表達(dá)，同時(shí)增加細(xì)胞死亡。肝臟特異性p53靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄激活還需要C末端的額外作用。據(jù)作者推測(cè)，抑制凋亡基因的表達(dá)與增強(qiáng)肝臟特異性靶點(diǎn)的活化共同賦予了組織特異性抗輻射能力。本文于2023年3月發(fā)表在《Cell Reports》IF：8.8期刊。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、DNA損傷可誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟p53依賴性細(xì)胞凋亡，但對(duì)肝臟無(wú)影響
       以前的研究發(fā)現(xiàn)胸腺和脾臟是體內(nèi)輻射敏感組織，而肝臟不是。為驗(yàn)證這些結(jié)論，對(duì)21天大的野生型C57/BL6小鼠進(jìn)行2Gy的全身X射線照射。在處理6小時(shí)后，胸腺和脾臟出現(xiàn)大量的凋亡，而肝臟則沒(méi)有（圖1A）。使用p53基因缺失的小鼠證明胸腺和脾臟的這些效應(yīng)確實(shí)是p53依賴性的（圖1B）。免疫印跡法用于確定三種組織中p53的相對(duì)表達(dá)水平。在這些研究中，凝膠中的每個(gè)泳道代表一只動(dòng)物。在X射線照射3小時(shí)后，p53在三種組織中的表達(dá)被誘導(dǎo)，并在6小時(shí)后開(kāi)始減弱（圖1C）。定量測(cè)量p53和actin條帶的相對(duì)強(qiáng)度表明，盡管肝臟p53的表達(dá)水平可能較低，但無(wú)論是在治療前（0 h）還是在輻射后（3 h），這三種組織中p53的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（圖1D）。仔細(xì)研究p53蛋白水平對(duì)輻射的反應(yīng)表明，胸腺和脾臟中的p53有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加（分別為p = 0.002和p = 0.001），但肝臟中的情況并非如此（p = 0.36）。然而，肝臟顯示出強(qiáng)大的p53靶基因反應(yīng)（見(jiàn)下文）。
2、X射線處理導(dǎo)致共同的和組織特異性的p53轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
       為確定對(duì)全局基因表達(dá)的影響，野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射線照射。從肝臟、胸腺和脾臟中收集RNA，并進(jìn)行RNA-seq分析。基因表達(dá)顯著改變的基因數(shù)量因組織而異，脾臟最多（3132個(gè)基因），其次是胸腺（481個(gè)基因）和肝臟（324個(gè)基因）。在這三種組織中，基因表達(dá)的上調(diào)高于抑制（圖1E）。為確定這些基因表達(dá)變化對(duì)p53的依賴性，在相應(yīng)的p53-null組織中測(cè)定輻射對(duì)野生型組織中顯著改變的基因表達(dá)的影響（圖1F）?；鹕綀D顯示，在肝臟中明顯改變的324個(gè)基因中，298個(gè)（92%）的表達(dá)依賴于p53。有趣的是，所有胸腺基因的表達(dá)都依賴于p53。但在脾臟中，在3132個(gè)已鑒定的基因中，298個(gè)基因在p53缺失小鼠中也發(fā)生了改變，其中2834個(gè)基因（90%）依賴于p53（圖1F）。
       對(duì)相應(yīng)組織進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）分析，以確定p53的占據(jù)位點(diǎn)?；虮磉_(dá)水平脾臟顯示了最多的輻射改變基因（3132個(gè)，而肝臟為324個(gè)，胸腺為481個(gè)）（圖1E），而與此相反，肝臟具有最多的p53基因占據(jù)的重要位點(diǎn)（3872個(gè)，而胸腺為2405個(gè)，脾臟為2604個(gè)）（圖1G）。將RNA-seq數(shù)據(jù)與ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，以鑒定對(duì)輻射反應(yīng)顯著表達(dá)改變同時(shí)也有相關(guān)的ChIP-seq峰的基因。這樣就鑒定出在放射后上調(diào)（圖1H）或下調(diào)（圖1I）的真正的p53靶點(diǎn)。盡管上調(diào)基因在不同組織間有相當(dāng)大的重疊，但下調(diào)靶點(diǎn)具有高度的組織特異性。

圖1 DNA損傷誘導(dǎo)胸腺和脾臟p53依賴性細(xì)胞凋亡，而不是肝臟，其具有共同的和組織特異性的p53轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3、X射線誘導(dǎo)了p53的共享核心直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)
       整合RNA-seq和ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，20個(gè)基因在肝臟、胸腺和脾臟這三種組織中均顯著上調(diào)，且在基因的10 kb范圍內(nèi)或基因本身至少有一個(gè)ChIP峰。這20個(gè)基因的上調(diào)在所有受檢組織中都依賴于p53（圖2A和2B）。選擇了三個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（圖2C）。Ccng1、Phlda3和Aen都上調(diào)了3-12倍，前兩個(gè)基因在每個(gè)組織中都明顯依賴于p53（圖2C）。對(duì)這三個(gè)基因的ChIP-seq圖譜的研究證實(shí)，在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的地方存在穩(wěn)健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在額外的峰（圖2D）。在這20個(gè)基因中，所有基因都至少有一個(gè)峰與p53 motif相關(guān)（圖S3B），這些motif與之前發(fā)表的p53特異性DNA結(jié)合共識(shí)序列非常吻合（圖2D），對(duì)所有20個(gè)共有基因的類似分析提供了一個(gè)與之前確定的非常相似的motif（圖2E）。有趣的是，這些峰值在基因體內(nèi)本身也同樣存在，如在基因的上游，只有少數(shù)位點(diǎn)位于下游（圖2F）。GSEA顯示，GO_BP與先前與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的p53 DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的基因有關(guān)（圖2G）。綜上所述，20個(gè)共享基因的發(fā)現(xiàn)（其中許多基因先前已被鑒定為p53靶標(biāo)）使人們對(duì)這些RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)集及其用于進(jìn)一步評(píng)估充滿信心。

圖2 X射線誘導(dǎo)了p53的共享核心直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)

4、肝臟p53不能上調(diào)凋亡基因
       為闡明胸腺和脾臟與肝臟對(duì)輻射的不同生物反應(yīng)的基礎(chǔ)，接下來(lái)確定了敏感組織中特異性上調(diào)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80個(gè)基因在胸腺和脾臟中的表達(dá)在輻射后增加，而在肝臟中沒(méi)有變化（圖3A）。所有這80個(gè)基因都有與之相關(guān)的ChIP峰，并被認(rèn)為是p53的真正靶標(biāo)。GSEA顯示與細(xì)胞凋亡相關(guān)的生物過(guò)程是富集率最高的（圖3B）。與凋亡過(guò)程基因集重疊的21個(gè)基因被證實(shí)其基因表達(dá)依賴于p53，并且在肝臟中不表達(dá)（圖3C）。qRT-PCR被用來(lái)證實(shí)這些基因的一個(gè)子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾臟中確實(shí)是選擇性靶點(diǎn)，但在肝臟中不是，并且它們的表達(dá)依賴于p53（圖3D）。一個(gè)共同的靶點(diǎn)Cdkn1a在所有三個(gè)組織中作為p53依賴性基因表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。在10周齡小鼠中檢測(cè)Bbc3 (Puma)時(shí)，在蛋白和mRNA水平發(fā)現(xiàn)了類似的組織特異性。值得注意的是，與胸腺和脾臟相比，肝臟的DNA損傷反應(yīng)減弱，這可通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)p53在絲氨酸15處的磷酸化和γH2AX的水平來(lái)確定（圖S2）。這就提出了一種可能性，即基因表達(dá)的組織特異性可能與對(duì)X射線的不同敏感性有關(guān)。盡管如此，肝臟確實(shí)顯示出其他組織所沒(méi)有的基因亞群的占據(jù)和表達(dá)（圖1H）。肝臟特異性p53靶點(diǎn)的存在降低了上游信號(hào)傳導(dǎo)受阻導(dǎo)致觀察到的結(jié)果的可能性，但并不排除這種可能性。

圖3肝臟p53不能上調(diào)凋亡基因

5、無(wú)法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少
       肝臟p53不能上調(diào)凋亡靶點(diǎn)的分子基礎(chǔ)可能是由于基因占據(jù)受損或DNA結(jié)合后的步驟。為解決這個(gè)問(wèn)題，作者研究了三個(gè)關(guān)鍵凋亡靶標(biāo)（Bbc3、Pmaip1和Bax）的ChIP-seq圖譜。在輻照胸腺和脾臟中，三個(gè)基因都觀察到強(qiáng)大的p53峰值。令人驚訝的是，在肝臟中，這三個(gè)基因的p53占據(jù)率也相似（圖4A）。為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，野生型p53小鼠體內(nèi)用另一種DNA損傷劑多柔比星處理，并對(duì)肝臟和脾臟組織進(jìn)行分析。進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)兩個(gè)共享靶標(biāo)Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并與兩個(gè)凋亡靶標(biāo)Bbc3和Pmaip1進(jìn)行比較。與X-射線照射后的結(jié)果一致，多柔比星處理導(dǎo)致肝臟和脾臟中Cdkn1a和Mdm2的增加，而B(niǎo)bc3和Pmaip1僅在脾臟中被誘導(dǎo)（圖4B）。然后對(duì)相應(yīng)的肝臟和脾臟組織樣本進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。與X-射線的結(jié)果一樣，多柔比星處理后，在肝臟和脾臟的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反應(yīng)元件上檢測(cè)到p53的占據(jù)，Alb基因的一個(gè)區(qū)域被用作陰性對(duì)照（圖4C）。

圖4無(wú)法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少

6、肝臟中p53靶基因表達(dá)的抑制有兩種機(jī)制
       迄今為止的研究結(jié)果表明，胸腺和脾臟靶標(biāo)中的三個(gè)，即Bbc3、Pmaip1和Bax，被肝臟p53占據(jù)，但在該組織中對(duì)X射線或多柔比星處理沒(méi)有調(diào)節(jié)（圖3和圖4）。然后研究了80個(gè)胸腺和脾臟靶點(diǎn)中有多少具有類似的特性，即它們也被p53占據(jù)但在肝臟中不被上調(diào)。在胸腺和脾臟中，所有這80個(gè)基因都顯示出與相應(yīng)的p53占位有顯著差異的基因表達(dá)（圖5A）。有趣的是，這些基因中的大多數(shù)在肝臟中也顯示出顯著的占位，調(diào)整后的p < 0.20（圖5A）。值得注意的是，與胸腺和脾臟相比，這些基因在肝臟中的占據(jù)率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高（圖5B，左）。兩個(gè)代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq圖譜顯示，p53在所有三個(gè)組織中都有很強(qiáng)的占據(jù)率（圖5B，中）。總之，80個(gè)基因中有74個(gè)被肝臟p53占據(jù)，其中所有與GO凋亡過(guò)程基因組重疊的基因都在這里被發(fā)現(xiàn)（下劃線基因，圖5B，右）。這些峰值主要出現(xiàn)在上游區(qū)域（圖5B，左下）。將這些峰中的p53 motif進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們與之前確定的p53共識(shí)有合理的匹配（圖5B，右下）。
       相比之下，其余6個(gè)基因在肝臟中沒(méi)有與之相關(guān)的穩(wěn)健的p53 ChIP峰（圖5C，左）。展示了ChIP-seq圖譜的兩個(gè)例子（Hgfac和Dcaf4）（圖5C中）。圖5C右展示了6個(gè)基因的列表。在胸腺和脾臟中發(fā)現(xiàn)的這些峰值，但在肝臟中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，也大多出現(xiàn)在基因體內(nèi)（圖5C，左下）。這些峰中的p53 motif也與p53共識(shí)相似（圖5C右下）。
       值得注意的是，在74個(gè)顯示肝臟p53占位的基因中，有7個(gè)基因有多個(gè)相關(guān)的ChIP峰，其中至少有一個(gè)峰在肝臟樣本中丟失。圖5B右側(cè)紫色顯示了這些基因。在ChIP峰與特定p53靶基因的功能注釋出現(xiàn)之前，很難明確論證這一點(diǎn)的相關(guān)性。然而，肝臟p53對(duì)這些基因缺乏調(diào)控仍有可能是由于這些其他位點(diǎn)缺乏占位。

圖5 肝臟p53靶基因表達(dá)缺陷有兩種機(jī)制

7、p53的C端阻止了肝臟中p53凋亡靶點(diǎn)的上調(diào)
       肝臟p53不能上調(diào)胸腺和脾臟的大部分靶標(biāo)似乎不是由于基因占據(jù)受損。這表明下游轉(zhuǎn)錄事件受到了影響，這種影響很可能是由于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。由于p53的CTD過(guò)去已被證實(shí)可介導(dǎo)p53與基因表達(dá)相關(guān)的輔助因子的結(jié)合，因此研究了受損肝臟p53反應(yīng)對(duì)CTD的需求。之前文獻(xiàn)已經(jīng)產(chǎn)生了一個(gè)小鼠模型，其中內(nèi)源性Trp53基因表達(dá)了一個(gè)缺少最后24個(gè)氨基酸的截短蛋白。同卵p53Δ24/Δ24小鼠在出生后兩周內(nèi)死亡，因此不適合在此進(jìn)行研究。然而，雜合子p53Δ24/-小鼠壽命正常，無(wú)明顯表型。因此，對(duì)p53Δ24/-小鼠進(jìn)行X-射線處理并分析p53靶點(diǎn)的表達(dá)。與p53+/-小鼠相比，Δ24/-小鼠肝臟、胸腺和脾臟中某些p53靶點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)（圖6）。CTD的缺失對(duì)胸腺或脾臟中共有靶點(diǎn)Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾臟特異靶點(diǎn)Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表達(dá)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響（圖6A）。相反，缺失CTD后，肝臟中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，但Bax的誘導(dǎo)作用不增強(qiáng)（圖6A）。值得注意的是，輻射后p53+/-肝臟中mRNA幾乎沒(méi)有變化的Bbc3，現(xiàn)在在p53Δ24/-肝臟中被輻射誘導(dǎo)。進(jìn)行免疫印跡以確定CTD的缺失是否改變了p53蛋白的表達(dá)（圖6B）。多個(gè)印跡的定量證實(shí)不同組織的p53水平相當(dāng)（圖6C）。p53蛋白水平的誘導(dǎo)在不同組織和基因型中同樣相似。與p53Δ24/-肝臟中Bbc3 mRNA的誘導(dǎo)一致，Puma蛋白也被強(qiáng)有力地誘導(dǎo)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B和6C）。因此，CTD的缺失允許肝臟特異性上調(diào)凋亡靶標(biāo)，特別是在輻射處理后的Bbc3。

圖6 p53的C端阻止了肝臟中p53凋亡靶點(diǎn)的上調(diào)

8、p53的C端阻止X射線誘導(dǎo)的肝臟凋亡
       為觀察CTD缺失后觀察到的基因表達(dá)變化是否會(huì)影響X射線治療后的生物學(xué)結(jié)果，對(duì)p53+/-和p53Δ24/-小鼠的肝組織進(jìn)行了TUNEL檢測(cè)（圖7A）。顯微照片證實(shí)p53+/-肝臟在輻射前后幾乎沒(méi)有TUNEL陽(yáng)性（圖7A，左）。這與同源野生型p53小鼠的情況相似（圖1）。相反，p5324/-肝臟顯示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加。對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)中的此類顯微照片進(jìn)行定量顯示增加了7倍（圖7A，右）。這與CTD缺失增強(qiáng)肝臟輻射敏感性的觀點(diǎn)一致，同時(shí)伴隨著關(guān)鍵凋亡靶標(biāo)Bbc3及其相應(yīng)蛋白Puma表達(dá)的增加。鑒于全長(zhǎng)p53在這些組織中的基礎(chǔ)凋亡率很高，因此與肝臟相比，去除CTD的影響輕微也就不足為奇了（圖7A）。
9、p53的C端是肝臟特異性基因表達(dá)的關(guān)鍵決定因素
       CTD缺失對(duì)輻射誘導(dǎo)的在肝臟中的一組候選基因的表達(dá)有明顯的影響（圖6）。然后進(jìn)行RNA-seq分析，對(duì)CTD缺失的后果進(jìn)行更全面的展示（圖7B-7K）。當(dāng)比較p53+/-肝臟和相應(yīng)的p53Δ24/-組織時(shí)，274個(gè)基因在輻射后3小時(shí)有差異表達(dá)。GSEA顯示，p53+/-肝臟中表達(dá)量增加的基因所富集的GO項(xiàng)與p53Δ24/-肝臟中表達(dá)量增加的基因所富集的GO項(xiàng)不同。值得注意的是，p53Δ24/-肝臟中調(diào)控增強(qiáng)的基因的GO富集包括 "程序性細(xì)胞死亡"（圖7C）。這些差異也可能是由于基礎(chǔ)基因表達(dá)的改變。為從進(jìn)一步分析中排除這些基因，在0 h時(shí)對(duì)兩種基因型的肝臟進(jìn)行了比較（圖S7A）。這樣就剩下了241個(gè)基因，它們代表了那些基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在3 h時(shí)調(diào)控發(fā)生改變的基因（圖7D）。其中，191個(gè)基因在p53+/-肝臟中增加，而50個(gè)基因在p53Δ24/-組織中增加（圖7E）。因此，有兩類基因：僅在p53+/-肝臟中被激活而在p53Δ/-中未被激活的基因(191個(gè)基因)和僅在p53Δ/-肝臟中被激活而在p53+/-中未被激活的基因(50個(gè)基因)（圖7E）。對(duì)每組基因都進(jìn)行了檢查，以確認(rèn)它們確實(shí)具有輻射反應(yīng)性。
       第一組中的191個(gè)基因在p53+/-肝臟中是靶基因，但在p53Δ/-組織中失去了反應(yīng)性，其中只有46個(gè)基因具有輻射反應(yīng)性（圖7F）。這些基因似乎是肝臟特異性的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)基因在胸腺或脾臟中不會(huì)隨輻射而改變（圖7G）。在這種情況下，CTD似乎是肝臟特異性基因表達(dá)所必需的。與ChIP-seq研究結(jié)果（圖1H）結(jié)合顯示，這些基因被p53特異性地占據(jù)（圖7H）。因此，有一部分靶點(diǎn)是肝臟特異性的（在胸腺或脾臟不受調(diào)控），它們的激活依賴于完整的CTD。肝臟特異性與基因在肝臟而非胸腺或脾臟的選擇性占據(jù)有關(guān)。CTD在這種情況下發(fā)揮作用的根本原因可能是通過(guò)多種機(jī)制，仍有待闡明（圖7L）。
       在p53Δ24/-肝臟中顯示調(diào)控增強(qiáng)的50個(gè)基因中，13個(gè)基因在p53Δ/-肝臟中被輻射誘導(dǎo)，而在p53+/-肝臟中沒(méi)有被輻射誘導(dǎo)（圖7I）。事實(shí)上，其中許多是胸腺和脾臟的靶標(biāo)（圖7J）。事實(shí)上，其中兩個(gè)（Rhbdf2、Rxylt1）在胸腺和脾臟中是野生型p53的靶點(diǎn)，但在肝臟中不是（圖7I和7J）。CTD的缺失使這些基因在肝臟中被激活。將這些結(jié)果與同基因+/+小鼠的ChIP-seq數(shù)據(jù)（圖1G）相結(jié)合，可以發(fā)現(xiàn)所有這些基因都被肝臟p53占據(jù)（圖7K）。這表明這些基因與肝臟中的p53相關(guān)，但只有在缺失CTD時(shí)才能被激活。一種可能的解釋是抑制因子與肝臟中的CTD相關(guān)（圖7M）。CTD的缺失將阻止抑制因子的結(jié)合，從而導(dǎo)致激活。值得注意的是，有33個(gè)基因在基本或輻射后CTD缺失時(shí)均表現(xiàn)出差異表達(dá)（圖7D）。有趣的是，其中許多基因?qū)儆?0個(gè)跨組織共享基因（圖2）。其中三個(gè)基因（Aen, Eda2r, Zfp365）通過(guò)qRT-PCR得到證實(shí)。在這些情況下，X-射線照射后出現(xiàn)的激活增強(qiáng)不僅僅是由于基礎(chǔ)表達(dá)的增加。
       GSEA顯示，這兩組基因（CTD需要表達(dá)的基因和CTD抑制表達(dá)的基因）具有不同的GO術(shù)語(yǔ)（圖7L和7M）。

圖7 p53的C端阻止X射線誘導(dǎo)的肝臟凋亡，并決定肝臟特異性基因的表達(dá)

       總之，如下圖所示，本研究利用RNA-seq和ChIP-seq發(fā)現(xiàn)p53輻射反應(yīng)具有共享性和組織特異性；肝臟p53占據(jù)凋亡靶基因但不能調(diào)控其表達(dá)；p53 C末端抑制肝臟凋亡基因，賦予放射抗性；肝臟特異性基因?qū)椛浞磻?yīng)需要p53 C末端。

圖8 圖形摘要

實(shí)驗(yàn)方法
小鼠輻射建模和多柔比星處理，RNA提取，qRT-PCR，RNA-seq，ChIP-seq，TUNEL，免疫印跡
參考文獻(xiàn)
Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. Epub 2023 Mar 15. PMID: 36924496; PMCID: PMC10200257.

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