環境苯并(a)芘(BaP)及其最終代謝產物BPDE(苯并(a)芘-7,8-二氫二醇-9,10-環氧化物)是典型的持久性有機污染物和內分泌干擾物。BaP/BPDE暴露可引起人滋養細胞功能障礙并誘發流產。然而，潛在的機制在很大程度上仍然難以捉摸。在本研究中，我們發現BPDE暴露通過上調NLRP3/Caspase1/GSDMD通路誘導人滋養細胞焦亡。我們還發現lnc-HZ14在暴露于BPDE的滋養細胞和復發性流產(RM)絨毛組織中高表達。Lnc-HZ14通過促進IRF1介導的ZBP1轉錄，增加METTL3介導的m6A甲基化NLRP3 mRNA及其穩定性，增強ZBP1/NLRP3蛋白相互作用，促進滋養細胞焦亡。lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸下調可有效緩解BPDE誘導的滋養細胞焦亡。從lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸的上調可以看出，RM比HC的絨毛組織有更高水平的焦亡。在BaP暴露小鼠模型中，BaP暴露通過上調小鼠Zbp1/Nlrp3軸誘導胎盤組織焦亡和流產，敲低NLRP3可有效減少胎盤焦亡，減輕BaP誘導的小鼠流產。血清IL-1β蛋白水平可能是預測流產風險的一個有希望的指標。這些發現為BaP/BPDE誘導的滋養細胞焦亡和流產提供了新的認識，并可能有助于進一步評估BaP/BPDE對雌性生殖的毒理學影響。本文于2023年5月發表于“Journal of Hazardous materials”（IF=13.6）上。
技術路線

結果
1）BPDE暴露通過上調NLRP3通路誘導滋養細胞焦亡
       我們用BPDE處理人滋養層細胞(Swan 71和HTR-8/ SVneo)，并探討BPDE暴露是否會導致滋養層細胞焦亡。我們發現BPDE暴露導致滋養細胞腫脹(圖1A)，這是一種典型的細胞焦亡形態。然后，我們檢測了BPDE暴露的人滋養細胞中焦亡通路的表達水平。BPDE暴露增加了暴露于BPDE的人滋養細胞中NLRP3的mRNA水平(圖1B)以及NLRP3、Pro-Caspase 1、cleave-Caspase 1、GSDMD和GSDMD-N的蛋白水平(圖1C)。此外，BPDE暴露的滋養細胞中裂解-IL-1b水平也升高(圖1C)。綜上所述，BPDE暴露通過上調NLRP3/Caspase1/GSDMD途徑誘導滋養細胞焦亡。

2）Lnc-HZ14在BPDE暴露的人滋養細胞中表達上調，通過上調NLRP3通路促進滋養細胞焦亡
       在我們最近的研究中，我們對暴露于BPDE的Swan 71細胞進行了全轉錄組測序，并鑒定出一組新的lncRNA。在這項工作中，我們重點研究了lnc-HZ14。我們進一步驗證了lnc-HZ14在BPDE暴露的Swan 71和HTR-8/SVneo細胞中高表達(圖2A)。CCK8結果顯示，BPDE暴露誘導滋養細胞死亡，lnc-HZ14的敲低減少了BPDE誘導的滋養細胞死亡(圖2B)，表明BPDE暴露至少部分通過上調lnc-HZ14誘導滋養細胞死亡。為了進一步探索其調控作用，我們以空載體細胞為對照組，在人滋養細胞Swan 71細胞中過表達lnc-HZ14，并通過RT-qPCR驗證其效率。然后對這些細胞進行mRNA測序，得到1128個下調mRNA和589個上調mRNA (圖2C)。對這些差異表達mRNA的GO(圖2D)分析顯示，lnc-HZ14可能調節滋養細胞免疫系統、先天免疫反應以及生長和死亡，這些都與細胞焦亡有關。在測序數據中，我們還發現lnc-HZ14過表達的Swan 71細胞中，NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-1 β等焦亡相關基因的mRNA水平均顯著升高(圖2E)，這表明lnc-HZ14可能調節滋養層細胞的焦亡。為了進一步驗證這一點，lnc-HZ14在Swan 71和HTR-8/ SVneo細胞中過表達或沉默。lnc-HZ14過表達導致滋養層細胞焦亡(圖2F)。lnc-HZ14過表達也降低了滋養層細胞的活力，這種降低可以通過用VX765(一種典型的細胞焦亡抑制劑)處理細胞來逆轉(圖2G)。過表達lnc-HZ14使NLRP3、Caspase1、GSDMD mRNA水平升高，NLRP3、Pro-Caspase1、cleave-Caspase1、GSDMD、GSDMD-N蛋白水平升高(圖2H、J)；而lnc-HZ14的敲低則降低了NLRP3和Caspase1的mRNA和蛋白表達水平，而對cleaved-Caspase1和GSDMD-N的表達水平影響不大(圖2I,K)。與此同時，lnc-HZ14過表達的滋養細胞中，cleave-IL-1β蛋白水平也較高，而lnc-HZ14沉默的細胞中，cleave-IL-1β蛋白水平沒有進一步下降(圖2J,K)。綜上所述，lnc-HZ14在BPDE暴露的人滋養細胞中高表達，通過上調NLRP3/Caspase1/GSDMD通路促進滋養細胞焦亡。

3）Lnc-HZ14增強了METTL3介導的NLRP3 mRNA的穩定性
       隨后，我們探討了lnc-HZ14如何調節NLRP3 mRNA水平。首先，我們評估了lnc-HZ14對NLRP3 mRNA穩定性的影響。Lnc-HZ14過表達增強了兩種滋養細胞中NLRP3 mRNA的穩定性(圖3A)。MeRIP實驗證實了NLRP3 mRNA的m6A修飾(圖3B)。隨后，我們發現lnc-HZ14過表達增加了NLRP3 mRNA的m6A修飾水平(圖3B)。我們檢測了過表達或敲低METTL3或METTL14的滋養細胞中NLRP3的mRNA水平。結果顯示，METTL3的過表達增加，而METTL3的敲低降低NLRP3的mRNA水平降低(圖3C)。然而，NLRP3的mRNA水平在METTL14的過表達或敲低后沒有顯著變化。因此，我們利用METTL3研究了NLRP3 mRNA的m6A修飾。NLRP3 mRNA的m6A修飾水平隨著METTL3過表達而升高，隨著METTL3敲低而降低(圖3D)。因此，METTL3過表達上調，而METTL3敲低則下調NLRP3蛋白水平(圖3E)。此外，lnc-HZ14過表達也上調，而lnc-HZ14敲低則降低METTL3蛋白水平(圖3F)。過表達lnc-HZ14進一步增加了NLRP3 mRNA上m6A修飾水平(圖3B)。綜上所述，lnc-HZ14上調了METTL3表達水平，增加了METTL3介導的NLRP3 mRNA上m6A修飾水平，從而增強了NLRP3 mRNA的穩定性。

4）Lnc-HZ14促進了IRF1介導的ZBP1轉錄及其蛋白與NLRP3的相互作用
       有報道稱ZBP1可誘導NLRP3活化，形成ZBP1-NLRP3炎性體，誘導細胞焦亡。然而，其在滋養細胞焦亡中的形成及其作用尚未被研究。因此，我們探索lnc-HZ14是否以及如何調節ZBP1的表達水平。有報道稱，在原代骨髓源性巨噬細胞(BMDM)和肺成纖維細胞中，IRF1是ZBP1的轉錄因子。在Swan 71細胞中，IRF1過表達上調，而IRF1敲低下調ZBP1 mRNA和蛋白水平(圖4A,B)。此外，lnc-HZ14過表達也增加，而lnc-HZ14沉默減少IRF1蛋白水平(圖4C)。mRNA測序數據顯示，在lnc-HZ14過表達的Swan 71細胞中，ZBP1 mRNA水平顯著升高(圖2E)。隨后，我們發現lnc-HZ14過表達上調ZBP1 mRNA和蛋白水平(圖4C,D)；而lnc-HZ14的敲除下調了它們的表達水平(圖4C,D)。IRF1 ChIP實驗進一步表明，IRF1可以結合ZBP1的啟動子區域，lnc-HZ14過表達進一步增強了這種結合(圖4E)。雙熒光素酶報告基因實驗還顯示，IRF1對ZBP1的野生型啟動子序列具有轉錄活性，而對ZBP1的突變型啟動子序列沒有活性；lnc-HZ14過表達進一步增強了這種轉錄活性(圖4F)。雖然有報道稱ZBP1和NLRP3可以形成ZBP1-NLRP3炎性體，但它們之間是否存在物理相互作用尚不清楚。在滋養細胞中，我們發現ZBP1和NLRP3之間存在蛋白相互作用，并且這種相互作用隨著lnc-HZ14的過表達而進一步增強(圖4G)。因此，lnc-HZ14上調ZBP1和NLPR3的表達水平，也增強了它們之間的蛋白相互作用，從而促進ZBP1-NLRP3炎癥小體的形成和滋養細胞的焦亡。

5）BPDE暴露通過上調lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸誘導滋養細胞焦亡
       BPDE暴露還上調了ZBP1的mRNA和蛋白水平(圖5A、B)以及IRF1的蛋白水平(圖5B)，并在IRF1 ChIP檢測中增強了IRF1在ZBP1啟動子區域的占據(圖5C)，從而促進了IRF1介導的ZBP1 mRNA在BPDE暴露的滋養細胞中的轉錄。同時，BPDE暴露還增加了METTL3蛋白水平(圖5B)和NLRP3 mRNA上的m6A修飾水平(圖5D)。在BPDE暴露的Swan 71細胞中，METTL3的再敲低降低了NLRP3 mRNA上的m6A修飾(圖5E)。此外，lnc-HZ14、NLRP3或ZBP1的敲除降低了BPDE暴露的滋養細胞中cleaved-caspase 1和GSDMD-N的表達水平(圖5F)。在細胞表型上，BPDE暴露導致滋養細胞大量死亡，細胞腫脹、膜破裂等典型的焦亡形態；lnc-HZ14、NLRP3或ZBP1的敲低均可減少滋養層細胞的焦亡(圖5G)。綜上所述，BPDE暴露通過上調lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸誘導滋養細胞焦亡，下調lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸可有效緩解BPDE誘導的滋養細胞焦亡。

6）Lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸與RM絨毛組織焦亡有關
       為了探討絨毛組織是否可能發生焦亡，以及這種焦亡是否與流產相關，我們收集了原因不明復發性流產(RM)組和與其匹配的健康對照組(HC)組的絨毛組織樣本，并評估了幾種典型焦亡基因的表達水平。我們發現，與HC組相比，RM組NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-1β的mRNA水平(圖6A)以及NLRP3、Caspase1、cleave -Caspase1、GSDMD、GSDMD-N和IL-1β的蛋白水平均較高(圖6B、C)。隨后，在絨毛組織中分析lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸。首先，通過RT-qPCR分析證實，lnc-HZ14和ZBP1 mRNA在RM和絨毛組織中高表達(圖6D,E)。其次，RM組織中IRF1和ZBP1蛋白水平高于HC組織(圖6F,G)。IRF1 ChIP實驗進一步顯示，相對于HC絨毛組織，RM中更多的ZBP1啟動子區域被IRF1富集(圖H)。第三，與HC組織相比，RM組織的METTL3蛋白水平也更高(圖6F,G)。因此，在RM組織中，NLRP3 mRNA的m6A修飾水平也增加了(圖6I)。最后，隨機使用6個RM和HC絨毛組織樣本進行Co-IP檢測，結果顯示RM組被NLRP3拉下的ZBP1蛋白水平明顯高于HC組(圖6J,K)。因此，這些數據都支持RM組織相對于HC絨毛組織存在更高水平的焦亡，這可以通過lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸的上調來證明。

7）BaP暴露誘導小鼠胎盤組織焦亡和流產
       為了直接評估BaP暴露導致胎盤組織焦亡進而導致流產的因果關系，我們構建了一個小鼠模型，將妊娠小鼠暴露于BaP誘導流產。BaP暴露增加胚胎吸附，提高流產率(圖7A, B)。BaP暴露小鼠胎盤組織中Nlrp3 mRNA水平(圖7C)以及Nlrp3、Caspase1、cleaved -Caspase1、Gsdmd-N和Il-1β蛋白水平(圖7D、E)均高于對照組，表明BaP暴露導致BaP暴露小鼠胎盤組織焦亡并誘導流產。BaP暴露上調了BaP暴露小鼠胎盤組織中Zbp1 mRNA水平(圖7F)以及Irf1和Zbp1蛋白水平(圖7G,H)。此外，BPDE暴露也上調了Mettl3蛋白水平(圖7G,H)。我們還構建了以AS-Nlrp3(敲低小鼠Nlrp3)治療BaP暴露小鼠的流產干預模型。BaP暴露可上調Nlrp3、cleaved-Caspase1、Gsdmd-N和Il-1β蛋白水平，而敲低Nlrp3可下調其在BaP暴露小鼠胎盤組織中的表達水平(圖7I、J)。敲低Nlrp3進一步有效地減少了BaP暴露小鼠的胚胎吸附，降低了流產率(圖7K,L)。因此，這些結果表明，BaP暴露引起胎盤組織焦亡，進而導致BaP暴露小鼠流產。

8）血清IL-1β可作為預測流產風險的檢測指標
       IL-1β是一種典型的分泌性蛋白，是提示強烈炎癥反應的關鍵炎癥因子。然后，我們探討血清IL-1β是否可以作為預測流產風險的檢測指標。結果表明，HC組IL-1β水平范圍為9.99 ~ 43.6 pg/mL，平均±SD為27.1±9.56 pg/mL；RM組IL-1β水平范圍為16.7 ~ 69.8 pg/mL，平均±SD為44.7±15.6 pg/mL(圖8A,B)。與HC血清樣品相比，RM血清樣品中IL-1β水平顯著升高。HC血清中IL-1β蛋白水平呈正態分布(圖8C、D)。隨著血清IL-1β水平的升高，RM在總女性中的比例呈上升趨勢(圖8E)，表明血清IL-1β水平越高，流產風險越高。條件logistic回歸進一步證實了這一點(圖8F)。ROC曲線分析顯示，血清IL-1β水平在95%置信區間內的曲線下面積(AUC)值為0.830，表明IL-1β可能具有較好的預測能力，具有較高的特異性和敏感性(圖8G)。這些數據表明血清IL-1β蛋白水平可能是反映流產風險的有希望的指標。

結論
       我們的研究結果揭示了BaP/BPDE誘導滋養細胞焦亡和生殖毒性的潛在機制，指出了BaP/BPDE對雌性生殖的潛在風險。

實驗方法
細胞焦亡形態的顯微鏡成像，CCK-8，RT-qPCR，RNA穩定性分析，WB，ELISA，ChIP，熒光素酶報告基因實驗，Co-IP，MeRIP。
參考文獻
Wang R, Xu X, Yang J, Chen W, Zhao J, Wang M, Zhang Y, Yang Y, Huang W, Zhang H. BPDE exposure promotes trophoblast cell pyroptosis and induces miscarriage by up-regulating lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3 axis. J Hazard Mater. 2023 Aug 5;455:131543. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.131543.