缺氧依賴型乳腺癌細胞可通過促進糖酵解增強其致瘤性和轉移性。N6-甲基腺苷修飾（m6A）是常見的RNA修飾機制。本研究中，作者發現腫瘤缺氧可以轉錄誘導HIF1α，轉錄后抑制miR-16-5p的表達，促進YTHDF1的表達，并通過上調m6A修飾的PKM2促進腫瘤細胞糖酵解，最終增加乳腺癌細胞的腫瘤發生和轉移潛能。該研究于2022年3月發表在《Cell Death Disease》，IF：9.0。
技術路線

主要研究結果
1. 功能分析確定YTHDF1是乳腺癌致瘤性驅動因子
       作者首先使用TCGA和CPTAC數據庫分析得到乳腺癌中YTHDF1蛋白和mRNA表達水平顯著高于鄰近正常組織（圖1A和B），114名乳腺癌患者的TCGA數據顯示同樣結果（圖1C）。通過GEPIA2分析發現，YTHDF1高表達與乳腺癌患者的低生存率相關（圖1D）。此外，作者收集的22例乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織免疫組化結果顯示，其中18個樣本的癌組織中YTHDF1的表達水平較癌旁組織均有所升高，其余4例差異不明顯甚至低于癌旁（圖1E）。Western blot結果顯示，YTHDF1在乳腺癌組織中表達顯著上調（圖1F），在MCF10A和多種乳腺癌細胞中YTHDF1的mRNA和蛋白水平呈現同樣的上調趨勢（圖1G和H）。這些結果表明，YTHDF1上調是乳腺癌的一個標志。

圖1：YTHDF1在乳腺癌中上調且與預后不良相關

2. YTHDF1調控乳腺癌細胞增殖、侵襲與凋亡
       為進一步闡明 YTHDF1 在乳腺癌中的潛在調節作用，作者通過敲除YTHDF1研究其表型變化。靶向YTHDF1的siRNA轉染細胞后，YTHDF1蛋白和mRNA表達水平顯著下降（圖2A和B）。CCK8檢測結果顯示，YTHDF1敲低顯著抑制MDA-MB-231和MCF7細胞的生長（圖2C）。通過EdU染色進一步驗證YTHDF1敲低對乳腺癌細胞增殖的抑制作用（圖2D）。另外還發現 YTHDF1 敲低抑制乳腺癌細胞集落形成（圖 2E）。同時，細胞遷移和侵襲實驗表明，YTHDF1敲除后MDA-MB-231和MCF7細胞的遷移和侵襲能力顯著下降（圖2F）。經Annexin V/PI染色的流式細胞儀檢測結果顯示，YTHDF1敲低導致MDA-MB-231和MCF7細胞凋亡（圖2G）。以上結果表明YTHDF1在維持乳腺癌細胞惡性發展過程中發揮重要作用。

圖2：YTHDF1敲低抑制體外細胞增殖與侵襲

3. 缺氧導致乳腺癌細胞中YTHDF1表達上調
       缺氧可增強乳腺癌細胞增值與侵襲。為解臨床相關條件下YTHDF1在乳腺癌組織中的調控機制，作者進一步研究缺氧對乳腺癌細胞中YTHDF1表達的影響。結果發現，缺氧條件下YTHDF1的mRNA和蛋白表達水平在MDA-MB-231和MCF7細胞中顯著上調（圖3A和B）。此外，作者將HIF1α和HIF2α siRNA轉染MDA-MB-231和MCF7細胞發現，HIF1α基因的缺失導致YTHDF1表達中度降低，而HIF2α的缺失對YTHDF1表達沒有明顯影響。
       缺氧可以通過調節microRNAs來介導特異性標記物的轉錄后表達。為研究microRNAs可能參與缺氧介導的YTHDF1表達的過程，作者在多個microRNAs數據庫搜索篩選了29個可能與YTHDF1相互作用的microRNAs（圖3C），并進一步獲得參與缺氧介導YTHDF1過表達的10個microRNAs。然后作者發現，在缺氧條件下，miR-16-5p、miR-15a-5p和miR-23b-3p的表達水平顯著下降（圖3D）。通過轉染microRNAs的mimics，結果發現miR-16-5pmimics對YTHDF1 mRNA表達具有最顯著的抑制作用（圖3E）。為進一步闡明miR-16-5p在缺氧介導的YTHDF1表達中的調控作用，作者構建YTHDF1 3’UTR野生型和突變型的雙熒光素酶表達系統（圖3F），并與miR-16-5pmimics或miR-16-5p抑制劑共轉染。熒光素酶活性結果顯示，在YTHDF1 3’UTR野生型中，miR-16-5抑制劑可以逆轉miR-16-5p介導的熒光素酶表達活性下調，但不能逆轉YTHDF1 3’UTR突變型的熒光素酶活性降低效果（圖3G）。以上結果表明，腫瘤缺氧微環境可以通過增強HIF1α的表達以及抑制內源性miR-16-5p的表達來上調YTHDF1。

圖3：缺氧誘導YTHDF1在乳腺癌細胞中的表達

4. miRNA-16-5p靶向YTHDF1抑制乳腺癌細胞生長
       為確定miR-16-5p介導的YTHDF1抑制對乳腺癌細胞的影響，作者監測miR-16-5pmimics及抑制劑轉染乳腺癌細胞后的表型變化。他們首先觀察到miR-16-5p可以高靶向消除YTHDF mRNA和蛋白表達。然而，pCDNA3.1-YTHDF1×FLAG質粒與miR-16-5p模擬物共轉染可恢復乳腺癌細胞中YTHDF1蛋白表達水平（圖4A和B）。同時，CCK8檢測結果顯示，轉染miR-16-5pmimics可顯著抑制乳腺癌細胞增殖，而miR-16-5p與miR-16-5p抑制劑或YTHDF1表達質粒聯合使用可緩解miR-16-5p介導的抑制作用（圖4C和D）。EdU染色結果也支持miR-16-5p對腫瘤的抑制作用和YTHDF1表達質粒的挽救作用（圖4E和F）。作者同時也觀察到miR-16-5抑制乳腺癌細胞的克隆、遷移和侵襲，而加入miR-16-5p抑制劑或pCDNA3.1-YTHDF1×FLAG質粒則逆轉了腫瘤抑制作用（圖4G-J）。基于Annexin V/ PI染色的流分析進一步表明，轉染miR-16-5p可有效誘導MDA-MB-231和MCF7細胞凋亡，而YTHDF1表達質粒可緩解細胞凋亡（圖4K和L）。這些實驗結表明，miR-16-5p抑制YTHDF1表達同YTHDF1敲低作用效果一致，均能夠抑制乳腺癌細胞的惡性特征和誘導癌細胞凋亡，使miR-16-5p作為靶向調控YTHDF1表達治療形式的應用成為可能。

圖4：miR-16-5p通過下調YTHDF1抑制體外乳腺癌細胞增殖與侵襲

5. YTHDF1調控PKM2表達促進乳腺癌細胞糖酵解
       乳腺癌細胞通過糖酵解將大量乳酸終產物釋放到腫瘤細胞外微環境中導致其酸化。考慮到缺氧與YTHDF1之間的聯系，作者首先研究MDA-MB-231和MCF7細胞中YTHDF1被抑制后，缺氧條件下細胞外微環境的乳酸水平變化。作者發現YTHDF1敲低明顯改善缺氧時乳腺癌細胞外微環境酸化，同時顯著降低葡萄糖消耗和乳酸產生水平。這說明在乳腺癌細胞中，YTHDF1敲低可以阻斷葡萄糖代謝。為進一步闡明YTHDF1在乳腺癌細胞糖酵解調控網絡中的作用，作者利用YTHDF1抗體對細胞做了RIP處理，通過qPCR檢測糖酵解相關基因在乳腺癌細胞糖酵解調節網絡中的表達變化。實驗結果顯示，PKM2 mRNA被YTHDF1有效富集（圖5A）。由于YTHDF1通過識別和結合mRNA的m6A來調控靶基因表達，因此作者在RMBase v2.0數據庫中檢索了YTHDF1與PKM2 mRNA結合的m6A修飾基序，以確定YTHDF1與PKM2之間的相互作用。利用RAP-CLIP鑒定出PKM2與YTHDF1結合的mRNA m6A修飾基序是ATGGACT（圖5B）。關于YTHDF1識別m6A修飾位點后對PKM2的調控機制，作者發現敲低YTHDF1對PKM2 mRNA或蛋白的穩定性沒有明顯影響。因此，作者推測YTHDF1可能影響PKM2蛋白翻譯過程并通過構建靶向PKM2 CDS的雙熒光素酶報告系統來驗證這一假設。雙熒光素酶測定結果顯示，與對照組相比（圖5C），PKM2在YTHDF1敲低細胞系中的翻譯效率降低約40%。這些結果表明，YTHDF1主要通過介導PKM2蛋白翻譯過程影響PKM2信號傳導。
      為進一步研究YTHDF1-PKM2軸在乳腺癌發展過程中的參與作用，作者將YTHDF1敲除后發現，重新表達PKM2可以有效恢復乳腺癌細胞糖酵解活性（圖5D-G）。即使YTHDF1過表達，PKM2敲低后仍然抑制糖酵解（圖5H-K）。另外，流式細胞儀結果表明，重新表達PKM2可以逆轉YTHDF1敲低所誘導的細胞凋亡，而PKM2敲低和YTHDF1過表達聯合處理仍導致乳腺癌細胞嚴重凋亡（圖L和M）。這些結果表明，YTHDF1通過調節PKM2的表達影響乳腺癌細胞的糖酵解，從而對乳腺癌細胞的各種生物學活性產生深遠影響。

圖5：YTHDF1調控糖酵解中PKM2的表達

6. YTHDF1下調抑制乳腺癌細胞體內的生長
       為驗證YTHDF1在乳腺癌發展中的作用，作者利用皮下乳腺腫瘤的BALB / c小鼠進一步研究YTHDF1敲低對乳腺癌細胞致瘤的影響，并通過向4周齡雌性BALB / c小鼠注射YTHDF1 shRNA處理的4T1細胞構建相關模型。與對照組相比，作者觀察到YTHDF1缺失引起腫瘤體積明顯減小，細胞凋亡群體增加，并伴隨有腫瘤組織中PKM2表達降低（圖6A-C），這表明YTHDF1敲低通過抑制PKM2可有效抑制小鼠乳腺腫瘤生長。同時YTHDF1沉默也顯著減少小鼠乳腺腫瘤的肺轉移（圖6J）。此外，作者將YTHDF1過表達轉染的4T1細胞轉入4周齡雌性BALB / C小鼠中，通過監測腫瘤大小變化來評估YTHDF1過表達對BALB/C小鼠中乳腺癌細胞致癌性的影響。結果發現，與對照組相比，YTHDF1過表達導致皮下乳腺癌組織的大小和PKM2表達水平增加（圖6D-F）。同時，YTHDF1過表達也顯著增強了乳腺癌細胞的肺轉移能力（圖6K），具體表現在YTHDF1 過表達處理組轉移結節數量增加。這些結果均表明，YTHDF1是介導下游PKM2信號調控乳腺癌發生和轉移的正向調節因子。基于以上實驗結果，作者利用同樣的方法評估了miR-16-5p介導的YTHDF1抑制以及體內抗腫瘤作用。與陰性對照相比，miR-16-5p處理組誘導腫瘤組織中YTHDF1和PKM2的表達顯著降低。而且miR-16-5p處理組的腫瘤生長受到明顯抑制，給藥24天后，平均腫瘤體積大小約為對照組的1/4（圖6G-I），其肺轉移淋巴結數量遠遠低于其他兩組（圖6L）。對提取的腫瘤組織進行Western blot分析，其結果與體外實驗結果相似，即YTHDF1缺失抑制了小鼠異種移植腫瘤中PKM2表達。作者通過免疫組化進一步研究患者來源的乳腺腫瘤和鄰近正常組織中YTHDF1和PKM2表達水平，結果表明YTHDF1和PKM2在腫瘤組織中均上調，且兩者之間呈正相關（圖6M）。綜上所述， YTHDF1在促進乳腺腫瘤生長和體內轉移中起關鍵作用，而miR-16-5p通過選擇性抑制YTHDF1表現出潛在的抗腫瘤作用。

圖6：YTHDF1作為小鼠中調控乳腺癌細胞致瘤性和轉移性的治療靶標

結論
      綜上所述， YTHDF1表達水平上調可以通過調控PKM2蛋白翻譯促進糖酵解來增強乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。YTHDF1 介導的 m6A 甲基化修飾可能成為開發更先進的乳腺癌療法靶標。

實驗方法
細胞培養，免疫組化，菌落形成測定，細胞遷移和入侵實驗，siRNA 、shRNA或microRNA 轉染，CCK8，EdU染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot，RT-PCR，RIP，雙熒光素酶報告系統，transwell入侵試驗，小鼠動物模型，TCGA、CPTAC數據庫分析，葡萄糖和乳酸濃度測定
參考文獻
Yao X, Li W, Li L, Li M, Zhao Y, Fang D, Zeng X, Luo Z. YTHDF1 upregulation mediates hypoxia-dependent breast cancer growth and metastasis through regulating PKM2 to affect glycolysis. Cell Death Dis. 2022 Mar 23;13(3):258. doi: 10.1038/s41419-022-04711-1. PMID: 35319018; PMCID: PMC8940925.