在這項研究中，作者使用單細胞和空間轉錄組RNA測序，全面描繪了結直腸癌(CRC)和配對良好的肝轉移的細胞格局。作者從6例結直腸癌患者的27份標本中產生了41,892個CD45^-非免疫細胞和196,473個CD45⁺免疫細胞，發現CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群在肝轉移樣本中顯著增加，表現出高增殖能力和腫瘤激活特性，有助于改善患者的預后。在原發瘤和肝轉移瘤中觀察到不同的成纖維細胞特征。原發腫瘤中富含F3⁺的成纖維細胞通過表達促腫瘤因子而導致總體生存率下降。而肝轉移瘤中MCAM⁺成纖維細胞可能通過Notch信號途徑促進CD8_CXCL13細胞的產生。綜上所述，作者通過單細胞和空間轉錄組RNA測序，廣泛分析了原發和肝轉移結直腸癌細胞圖譜的轉錄差異，提供了結直腸癌肝轉移發生發展的不同維度。
       該研究于2023年6月發表發表在《Science advances》，IF：14.957。

技術路線

1、CRC原發腫瘤和CRC來源的肝轉移腫瘤的總體單細胞轉錄組圖譜
       為了闡明CRC原發腫瘤和CRC來源的肝轉移腫瘤的細胞異質性，作者從六名CRC患者的原發結直腸癌（CC）、相鄰正常結直腸粘膜（CN）、肝轉移（LM）、相鄰正常肝組織（LN）以及外周血（PB）中收集了CD45^?非免疫細胞和CD45⁺免疫細胞進行單細胞轉錄組分析（圖1A）。經過質量控制和過濾，作者從27個樣本中獲得了41,892個CD45^?非免疫細胞和196,473個CD45⁺免疫細胞，并鑒定出了23個非免疫細胞簇和41個免疫細胞簇。通過基于標記物的注釋，作者從非免疫細胞中鑒定出了腫瘤細胞（EPCAM和SOX9）、成纖維細胞（COL1A1和COL1A2）和內皮細胞（PECAM1和CD34），而從免疫細胞中鑒定出了T細胞（CD3、pAbO）、自然殺傷細胞（NK細胞）（CD56、pAbO）、B細胞/漿細胞（CD19、pAbO）、單核細胞/巨噬細胞（CD14、pAbO）、樹突狀細胞（DCs）（HLA.DRA）和肥大細胞（TPSAB1）。
       進一步對非免疫細胞主要群體進行無監督聚類分析，得到了11個腫瘤細胞簇、8個成纖維細胞簇和6個內皮細胞簇（圖1B）。CA2和F2_MCAM在LM中富集。F4_F3和F5_CCL11在CC中顯著富集（圖1C）。基于已知標記物的表達情況，將免疫細胞分為41個亞群（圖1D）。在原發腫瘤微環境（TME）中，調節性T細胞（Tregs）和巨噬細胞的百分比較CN對照組更高。雖然單核細胞、NK細胞和黏膜相關固有T細胞（MAIT細胞）在LN中占主導地位，但轉移腫瘤細胞對Tregs和巨噬細胞的顯著上調重塑了TIME（圖1E）。總之，作者在CRCLM的不同組織中鑒定出多個具有不同分布模式的細胞亞群。

2、 CRC原發腫瘤和CRC來源的肝轉移腫瘤的空間分布特征
       為了全面分析CRC原發腫瘤和CRC來源的肝轉移腫瘤的空間分布特征，作者從六名患者中收集了六個組織標本，包括四例CRC原發腫瘤（C1至C4）和兩例肝轉移腫瘤（L1和L2）。通過hematoxylin和伊紅（H&E）染色以及每個樣本的基因表達特征，識別出腫瘤區域（T）和腫瘤周圍區域（PT）（圖2A）。與腫瘤周圍組織相比，腫瘤組織富集了與細胞周期相關的通路，如G2-M檢查點、E2F靶點和有絲分裂紡錘體（圖2B）。根據基因表達譜，將腫瘤組織和腫瘤周圍組織分為不同的區域（圖2A）。考慮到每個區域包含多個細胞，作者采用了一種基于標記物的策略，將空間轉錄組（ST）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據整合起來，估計每個捕獲區域中不同細胞類型的比例。在ST組織中鑒定出B細胞、T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、漿細胞、髓系細胞、腫瘤細胞、成纖維細胞和內皮細胞。這些細胞簇的比例和得分在每個區域中有所變化。與C1、C3和C4的腫瘤周圍組織相比，漿細胞的比例在腫瘤組織中下降（圖2C和2D）。

3、原發和肝轉移瘤腫瘤細胞轉錄異質性
       研究表明，人類結直腸腫瘤細胞包含多種細胞類型，其轉錄特征反映了正常結直腸上皮的特征。在正常上皮中已經確定了干細胞樣/轉運增殖細胞、結腸細胞、腺細胞和毛刷細胞。進行了亞類聚類分析，并揭示了腫瘤細胞的不同分化譜系，即CA1到CA11。由單個腫瘤細胞產生的腫瘤組織可以概括出親本腫瘤的細胞多樣性。LM中的腫瘤細胞群體多樣性與CC相似（圖1C）。為了進一步研究不同腫瘤細胞簇的功能通路和轉錄程序，作者進行了基因集變異分析（GSVA）和轉錄因子（TF）分析。結果顯示，CA2富集了Wnt-β-catenin信號通路，并在CA2中上調了在Wnt-β-catenin信號通路中起重要作用的轉錄因子LEF1。此外，CA2表現出體細胞干細胞分裂通路的上調。一致的是，CA2具有最高的LGR5表達水平，這是腸道干細胞的標記物。這些結果表明，CA2可能是TME中的干細胞亞群。此外，CA2具有EPCAM、CDH1和PRSS2的高表達水平，促進腫瘤細胞的粘附和定植。總的來說，聚類鑒定和特征分析展示了腫瘤細胞的功能多樣化，轉移腫瘤能夠重現親本腫瘤的細胞多樣性。

4、TME重塑髓系細胞的組成
       髓系細胞是TME中異質的亞群，作者鑒定出了三種髓系細胞：單核細胞/巨噬細胞、樹突狀細胞（DCs）和肥大細胞。通過亞類聚類分析，作者鑒定出了八個單核細胞/巨噬細胞亞群和三個傳統DCs（cDCs）亞群（圖3A），并且每個亞群都具有獨特的基因表達模式。每個部位的髓系細胞具有不同的分布模式（圖3B），展示了器官特異性的特征。CD14+單核細胞是PB中最富集的亞群。與腫瘤周圍組織相比，Mac_SPP1亞群在腫瘤組織中富集，而大部分Mac_SPP1亞群細胞來自原發腫瘤。此外，Mac_CXCL9的比例在LM中顯著增加（圖3C），該亞群表達CXCL9的水平較高，表明該亞群能夠招募CXCR3陽性效應T細胞進入腫瘤。Mac_SPP1亞群中富集參與招募髓系細胞，尤其是粒細胞如CXCL3的基因（圖3D）。髓系抑制性細胞可以高表達CXCR2，CXCL3的受體，并且可以通過表達精氨酸酶和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）來抑制CD8+T細胞。GSVA分析顯示，Mac_SPP1亞群參與與炎癥反應相關的途徑。然而，Mac_CXCL9亞群在干擾素-γ（IFN-γ）反應和T細胞活化途徑中富集（圖3E）。軌跡分析顯示，Mac_CXCL9和Mac_SPP1亞群都是終末分化的，表明它們是腫瘤活化的亞群（圖3F）。
       根據細胞因子表達和功能，DCs可以分為漿細胞樣DCs（pDCs）和cDCs。在TME中已經鑒定出不同亞群的cDCs，包括cDC1和cDC2。在作者的數據中，CC和LM中都鑒定出了cDC1（cDC_CPNE3）和cDC2（cDC_CD1c）（圖3A）。此外，在LM中還富集了cDC_LAMP3（圖3C）。cDC_LAMP3表達CCR7的水平較高（圖3G），CCR7是CCL19和CCL21的受體，表明它具有遷移至淋巴結的能力。此外，cDC_LAMP3亞群表現出CD40、CD80和CD86這些共刺激分子的高表達水平，這是DC成熟的標記物（圖3H）。cDC_LAMP3亞群的百分比在LM中顯著增加，表明TIME中腫瘤細胞的增長。

5、CXCL13+T細胞在肝轉移腫瘤中的富集
       T細胞，特別是CD8+ T細胞和CD4+ T細胞，在適應性免疫應答中起主導作用。在T細胞中，鑒定出了七個CD8+ T細胞簇，五個傳統CD4+ T（cCD4）細胞簇和兩個調節性T細胞（Tregs）簇。CD8+ T細胞和CD4+ T細胞都包括表達CXCL13的簇，這是CXCR5的趨化因子（圖4A、B）。與LN相比，CD8_CXCL13細胞的百分比在LM中顯著增加；然而，在CN、LN和PB中很少檢測到這個亞群（圖4C和D）。在結腸的穩態下，大約3%至12%的CD4細胞為CXCL13陽性，這被稱為濾泡性輔助T細胞（TFH）。在CC中，CD4_CXCL13的百分比下降，但與LN相比，在LM中這個亞群的百分比增加（圖4E）。
       為了進一步研究CXCL13+ T亞群的特征，作者分析了每個亞群中上調的通路。GSVA分析顯示，CD8_CXCL13亞群富集了T細胞增殖通路，而CD4_CXCL13亞群富集了G2-M檢查點通路，顯示出這兩個亞群的增殖特性（圖4F和G）。每個簇的基因分析顯示，CD8_CXCL13細胞表達ITGAE的水平較高，ITGAE是組織駐留記憶T（TRM）細胞的標記物。考慮到TRM細胞也是CD69陽性的，作者通過流式細胞術鑒定了CD69+CD103+CD8+ T細胞。大多數CD103+細胞是CD69陽性細胞，而CD69+CD103+CD8+ T細胞在LN中很少出現。一致地，來自CC和LM的CD69+CD103+CD8+ T細胞中Ki67的表達水平高于其他CD8+ T細胞。來自CN和LN的不同CD8+ T細胞亞群的增殖特性幾乎相同（圖4H）。綜上所述，這些結果表明，由于其高增殖能力，CD8_CXCL13和CD4_CXCL13細胞在CRC的LM中上調。

6、CXCL13+T細胞與結直腸癌患者預后良好相關
       在上述結果中，作者展示了與CD4_CXCL13亞群相比，CD8_CXCL13在CC和LM中富集（圖4D和E），這表明CD8_CXCL13細胞可能是一種激活腫瘤的亞群。因此，作者進一步研究了CD8_CXCL13亞群的特征。與其他亞群相比，CD8_CXCL13亞群中觀察到了PDCD1、HAVCR2、LAG3、CTLA4和TIGIT等耗竭標記物的高水平（圖5A和B）。先前的研究顯示，由于持續的腫瘤抗原刺激，腫瘤反應性T細胞表現出衰竭表型，而衰竭表型表明它們的腫瘤反應性。軌跡分析顯示，CD8_CXCL13細胞是終末分化的（圖5C）。此外，CXCL13+ T細胞亞群在TME中表現出顯著的克隆擴增能力，進一步表明它們具有抗原經歷的特性。此外，CD8_CXCL13亞群還表達高水平的效應分子，如GZMB（圖5A和B），這表明該亞群可能保留了部分抗腫瘤功能。由于在組織中檢測CXCL13較為困難，作者嘗試使用CD69和CD103來標記CXCL13+細胞，免疫組織化學（IHC）結果顯示，在腫瘤組織中，CD69+CD103+CD8+ T細胞與CK19+腫瘤細胞更加接近（圖5D和E），有利于它們的抗腫瘤功能。值得注意的是，CD103+CD8+ T細胞存在于結直腸癌組織的第三淋巴結結構（TLS），TLS評分較高的患者CD8_CXCL13評分也較高，這表明該亞群可能參與了TLS的形成（圖5F和G）。
       為了探索CXCL13+ T細胞在結直腸癌中的預后價值，作者將來自基因表達庫（GEO）隊列的結直腸癌患者分為CXCL13高表達組和CXCL13低表達組，并發現CC中CXCL13的高表達預示著更好的總體生存率（圖5H）。總之，富集在TME中的CXCL13+ T細胞是一種對腫瘤具有反應性的亞群，并有助于結直腸癌患者的良好預后。

7、原發和肝轉移結的直腸癌中存在不同的成纖維細胞亞群
       成纖維細胞是TME中非免疫細胞的主要類型。作者進一步表征成纖維細胞，探索它們在原發結直腸癌和肝轉移腫瘤中的異質性。在結直腸癌的TME中鑒定出八個具有獨特基因表達模式的成纖維細胞亞群，分別被命名為F1_PRELP、F2_MCAM、F3_HAS1、F4_F3、F5_CCL11、F6_IGFL2、F7_COCH和F8_MKI67（圖6A）。F2_MCAM亞群在LM中的比例高于CC。F4_F3和F5_CCL11亞群大部分由CC來源的細胞組成（圖6B）。根據批量RNA測序數據，F4_F3的浸潤在CC中增加，與CN相比。然而，根據軌跡分析，F5_CCL11亞群在CC中的比例降低，可能轉變為F4_F3亞群（圖6C）。軌跡分析還預測F2_MCAM和F4_F3是兩個不同的終末分化亞群（圖6C）。IHC分析驗證了F2_MCAM在CC和LM中的存在（圖6D）。根據IHC結果，MCAM+CAF在LN中非常罕見。大部分MCAM+細胞是內皮細胞。然而，與單細胞分析一致，F4_F3亞群只存在于CC中，而在LM中不存在，這可能是由于LN中缺乏F4_F3而CN中存在的現象（圖6E和F）。ST分析也證實，在CC中F4_F3亞群的浸潤要比LM中多（圖6G和H）。F4_F3亞群緊密包圍CN和CC中的上皮細胞，促進其與上皮細胞的相互作用（圖6I）。此外，F4_F3在CC中的增加可能導致更差的預后（圖6J）。總之，作者觀察到原發結直腸癌和肝轉移腫瘤之間的成纖維細胞具有不同的表型特征和高度可變的頻率，這表明在不同癌癥環境中TME內存在細胞異質性。

8、原發腫瘤中富集表達F3的成纖維細胞亞群分泌促腫瘤因子，與結直腸癌患者預后不良有關
       為了研究在CC和LM中富集的不同成纖維細胞對TME的重塑作用，作者進一步分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。F2_MCAM富集了JAG1和NOTCH3，這兩者參與了NOTCH信號通路。F4_F3富集了C3和CXCL1，表明該亞群參與了補體和炎癥反應通路（圖7A和B）。F4_F3還高表達MMP2和MMP3，這可能與細胞外基質的組織結構有關（圖7A）。此外，F4_F3還富集了參與血管生成和腫瘤浸潤的促腫瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2（圖7C）。F4_F3與腫瘤細胞之間的相互作用分析進一步揭示了它們通過NRG1和Erb-B2受體酪氨酸激酶3（ERBB3）信號通路進行交流，而ERBB3幾乎富集在腫瘤細胞中，并可以與ERBB2形成異源二聚體，促進腫瘤細胞增殖并使CRC患者對西妥昔單抗產生耐藥性（圖7D）。ST分析還顯示了F3與NRG1的共定位，圍繞著ERBB3+腫瘤細胞（圖6G和圖7E至I）。跨膜遷移實驗顯示重組人NRG1（rNRG1）可以促進RKO和SW620細胞的遷移（圖7J）。高表達F3和NRG1的CRC患者預后較差（圖7K）。這些結果表明，富集于CC的F4_F3成纖維細胞通過分泌促腫瘤因子可能導致CRC患者預后不佳。

9、LM TME中表達MCAM的成纖維細胞通過Notch信號通路調節CD8_CXCL13細胞的產生
       在CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群中，Notch信號通路的轉錄因子RBPJ表達較高（圖5A）。有報道稱，Notch信號通路可以通過配體和受體的相互作用來激活。在與其配體相互作用后，Notch的胞內結構域可以被切割并轉位到細胞核中，調控其靶基因的轉錄。LM中RBPJ的表達與CXCL13和ITGAE呈正相關，而在CC中未觀察到這種關聯（圖8A）。CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群主要表達NOTCH1受體（圖8B）。為了進一步了解哪些細胞類型在CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群中調控Notch信號通路，作者分析了Notch配體的表達水平，包括DLL1、DLL3、DLL4、JAG1和JAG2，發現Notch配體主要在成纖維細胞和內皮細胞中表達。F2_MCAM亞群富集了JAG1，F5_COCH亞群富集了DLL1，而E2_DLL4亞群富集了DLL4、JAG1和JAG2（圖8C）。使用CellPhone DB進行的Notch及其配體的相互作用分析顯示，在內皮細胞中，E2_DLL4亞群與CXCL13+ T細胞之間的相互作用最強，而在成纖維細胞中，F2_MCAM亞群通過JAG1-NOTCH1與CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群相互作用（圖8D）。由于成纖維細胞在TME中的分布呈散點狀，作者推測F2_MCAM亞群有助于激活CXCL13+ T細胞中的Notch信號通路。
       接下來，作者根據LM中F2_MCAM的比例將患者分為兩組，并發現F2_MCAM高的LM中CD8_CXCL13亞群比例較高（圖8E）。通過GEO數據集分析發現，F2_MCAM浸潤評分較高的患者在LM中CD8_CXCL13亞群的浸潤評分也較高，但在CD4_CXCL13亞群和CC中未觀察到類似的關聯（圖8F）。此外，作者通過ST檢測了LM中F2_MCAM和CD8_CXCL13的位置。與單細胞結果一致，F2_MCAM浸潤評分較高的區域在ST樣本中CD8_CXCL13的浸潤評分也較高（圖8G和圖8H）。此外，LM中Notch信號通路的相互作用強度比CC中更強，這可能是由于LM中F2_MCAM亞群的比例較高（圖6B）。
       已有研究報道Notch信號通路調控CD8+ T細胞的抗腫瘤免疫，但對于Notch信號通路是否可以調控CXCL13的表達了解甚少。為了探索這種調控作用，作者使用JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）預測了RBPJ在CXCL13啟動子上的結合位點。發現了幾個潛在的結合位點，表明RBPJ可能作為轉錄因子影響CXCL13的表達。

10、ST組織中的細胞間相互作用網絡
       作者還研究了原發腫瘤和肝轉移瘤的ST中不同簇之間的細胞相互作用。結果顯示，VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配體受體對在原發腫瘤和肝轉移瘤中都富集。作者還發現CC和LM之間存在不同的富集配體受體對。ERBB3-NRG1配對在C1和C3中富集，但在L1和L2中不存在（圖9A），這表明ERBB3-NRG1相互作用在原發腫瘤的發展和轉移中可能具有潛在作用。
       綜上所述，作者發現在CRC原發腫瘤中富集的F3+成纖維細胞可以通過產生包括NRG1在內的各種促腫瘤因子來調節腫瘤的發展和/或遷移，這些因子與腫瘤細胞表達的ERBB3相互作用以發揮其促腫瘤功能。然而，在LM中富集的MCAM+成纖維細胞可以通過Notch信號通路調節CD8_CXCL13細胞的生成，與CC中的促腫瘤亞群F3+成纖維細胞不同，這表明不同癌癥環境中間質細胞的細胞異質性（圖9B）。

實驗方法
組織加工與細胞分選、scRNA-seq、無監督的細胞聚類和標注、ssGSEA、GSVA、SCENIC、Monocle2、Spatial-seq、流式細胞術、CellPhone DB、IHC染色、生存分析、基因表達相關性分析、Transwell遷移率分析。
參考文獻
Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16.