CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）已被確定在腎細胞癌（RCC）組織中表達上調，但其在RCC中的作用和貢獻尚不明確。作者證實了RCC細胞中circZBTB44的過度表達。在異種移植小鼠模型中，敲低CircZBTB44抑制了RCC細胞的活力、增殖和遷移，并抑制了腫瘤的發生。異質核糖核蛋白C （HNRNPC）和胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白3 （IGF2BP3）是circZBTB44的兩種RNA結合蛋白。HNRNPC通過m6A修飾促進circZBTB44從細胞核向細胞質的易位，促進了RCC細胞細胞質中IGF2BP3和circZBTB44的相互作用。此外，circZBTB44通過與IGF2BP3結合，在RCC細胞中上調己糖激酶3 （HK3）的表達。HK3對RCC細胞的惡性行為和腫瘤生長具有致瘤作用。在RCC細胞與巨噬細胞共培養中，circZBTB44通過上調HK3促進巨噬細胞M2極化。綜上所述，HNRNPC介導circZBTB44與IGF2BP3相互作用上調HK3，在體外促進RCC細胞的增殖和遷移，在體內促進腫瘤發生。本研究結果為RCC的靶向治療提供了新的思路。本文于2023年4月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊。

技術路線：

主要實驗結果：
1、circZBTB44在RCC組織和細胞中的表達
       作者對GSE100186、GSE108735和GSE137836數據集進行分析，結果顯示，CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）在RCC腫瘤組織中表達上調（圖1A）。隨后證實了circZBTB44在RCC細胞中的表達高于人腎近端小管上皮細胞（HK-2），特別是在A498和769-P細胞中（圖1B）。CircZBTB44 （chr11:130130750 - 130131824）位于第11號染色體上，與宿主基因ZBTB44外顯子2反向剪接（圖1C）。從PCR和電泳分析結果來看，circZBTB44僅在cDNA中擴增，在gDNA中未觀察到擴增產物（圖1D）。此外，作者還發現，與ZBTB44 mRNA相比，circZBTB44對RNase R處理具有抗性，這表明由于其圓形結構，circZBTB44比其線性mRNA更穩定（圖1E）。FISH和亞細胞分離實驗顯示，circZBTB44在RCC細胞的細胞質和細胞核中均有分布，細胞質中circZBTB44較多（圖1F-G）。

圖1 circZBTB44在RCC組織和細胞中的表達

2、CircZBTB44促進體外RCC細胞發育和體內小鼠腫瘤發生
       通過一系列功能實驗研究circZBTB44對RCC細胞惡性行為的影響。轉染si-circZBTB44-1/-2/-3后，RCC細胞中circZBTB44的表達顯著降低，ZBTB44 mRNA的表達不受si-circZBTB44的影響。si-circZBTB44-1和sicircZBTB44-2質粒表現出較好的沉默效果，并應用于后續實驗（圖2A）。然后作者評估了RCC細胞的活力和增殖潛力，發現circZBTB44-2沉默對RCC細胞的體外生長有明顯的抑制作用（圖2B-C）。此外，相對于對照組，si-circZBTB44-1/-2組中遷移的RCC細胞數量顯著減少（圖2D）。敲低circZBTB44可減少RCC細胞的創面愈合距離（圖2E），表明沉默circZBTB44可顯著抑制RCC細胞的遷移能力。研究表明，CircZBTB44在RCC細胞生長和遷移中起癌癥啟動子的作用。然后作者在體內檢測了circZBTB44基因敲低對小鼠腫瘤生長的影響。與對照組相比，si-circZBTB44組小鼠腫瘤組織樣本中的circZBTB44水平顯著降低（圖2F）。si-circZBTB44組與對照組相比，腫瘤大小和重量明顯減小（圖2G-H）。同樣地，沉默circZBTB44后，腫瘤生長速度降低（圖2I）。此外，免疫組化染色結果顯示，circZBTB44沉默導致Ki-67蛋白表達明顯降低，表明circZBTB44在體內刺激腫瘤生長（圖2J）。
 

  
圖2 CircZBTB44在體外促進RCC細胞惡性

3、CircZBTB44在RCC細胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用
       作者基于RBPsuite網站的預測和RNA pull-down-ms的結果，進一步探討circZBTB44在RCC中的調控機制。結果顯示HNRNPC和IGF2BP3可能與circZBTB44相互作用（圖3A）。接著作者檢測了circZBTB44沉默對HNRNPC和IGF2BP3表達的影響，qRT-PCR結果表明，RCC細胞中circZBTB44沉默對HNRNPC和IGF2BP3的表達沒有顯著影響（圖3B）。RNA pull-down實驗顯示，HNRNPC和IGF2BP3在bio-circZBTB44復合物中大量富集，這表明circZBTB44在RCC細胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用（圖3C）。同樣，作者觀察到circZBTB44在抗HNRNPC和抗IGF2BP3的沉淀中豐富富集，這證實了circZBTB44與HNRNPC或IGF2BP3之間的相互作用（圖3D）。人類蛋白質圖譜預測HNRNPC主要分布在細胞核中，IGF2BP3主要位于細胞質中（圖3E），免疫熒光實驗進一步證實了這一點（圖3F）。最后作者評估了HNRNPC和IGF2BP3之間的相互作用，結果顯示HNRNPC和IGF2BP3之間沒有直接的相互作用（圖3G）。

圖3 CircZBTB44在RCC細胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用。

4、HNRNPC增強了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通過m6A修飾介導circZBTB44向細胞質的易位
       HNRNPC是一種N6 -甲基腺苷（m6A）解讀器，調控RNA剪接、3’端加工和翻譯等RNA加工。假設HNRNPC參與了circZBTB44的調控。qRT-PCR結果驗證了siHNRNPC和siIGF2BP3在RCC細胞中轉染后， HNRNPC和IGF2BP3在RCC細胞中的表達顯著降低（圖4A）。MeRIP檢測結果顯示，circZBTB44在抗m6 A沉淀中顯著富集，沉默HNRNPC后抗m6A減少，而在RCC細胞中敲除IGF2BP3后無明顯變化，提示HNRNPC影響了circZBTB44的m6 A修飾（圖4B）。此外，作者使用SRAMP數據庫預測circZBTB44的m6A修飾位點，發現了4個具有高置信度的m6A位點（圖4C）。然后對4個m6A位點進行突變，RNA pull- down實驗結果表明，HNRNPC在Bio-circZBTB44-s3Mut拉下的復合物中不富集（圖4D）。然后檢測circZBTB44在細胞質和細胞核中的表達，qRT-PCR結果顯示，HNRNPC敲低顯著降低了circZBTB44的細胞質分布，提高了circZBTB44在RCC細胞細胞核中的表達（圖4E）。作者進一步探討了HNRNPC對circZBTB44和IGF2BP3相互作用的影響，HNRNPC缺失明顯降低了Bio-circZBTB44復合物中IGF2BP3的富集，提示HNRNPC沉默抑制了RCC細胞中circZBTB44和IGF2BP3的相互作用（圖4F）。同樣，RIP實驗結果表明，circZBTB44富集后，抗IGF2BP3的沉淀顯著減少（圖4G）。總體而言，HNRNPC通過m6A修飾促進circZBTB44向細胞質易位，增強了circZBTB44與IGF2BP3的相互作用。

圖4 HNRNPC增強了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通過m6 A修飾介導circZBTB44向細胞質的易位

5、CircZBTB44與IGF2BP3結合調節HK3 mRNA穩定性
       IGF2BP3與mRNA結合，調控靶基因表達。因此，作者對circZBTB44/IGF2BP3的下游靶點進行了研究。根據catRAPID數據庫預測的結果和之前的研究，發現HK3很可能與IGF2BP3結合，并且在RCC中也上調（圖5A）。作者檢測了circZBTB44敲低對HK3表達的影響，在circZBTB44沉默的RCC細胞中，HK3顯著下調（圖5B）。在HK3 3'UTR復合物中觀察到IGF2BP3的富集，這表明在RCC細胞中IGF2BP3與HK3 3'UTR結合（圖5C）。RIP實驗顯示，HK3 3'UTR復合物在抗IGF2BP3的沉淀中富集（圖5D）。α-amanitin處理并在RCC細胞中沉默IGF2BP3后，HK3 mRNA的穩定性顯著降低（圖5E）。FISH檢測結果顯示，circZBTB44、IGF2BP3和HK3在RCC細胞的細胞質中共定位（圖5F）。RIP實驗顯示，在circ ZBTB44沉默的RCC細胞中，抗IGF2BP3沉淀中HK3 3'UTR的富集顯著減少（圖5G）。qRT-PCR分析證實了circZBTB44的過表達效率（圖5H）。作者還觀察到，在RCC細胞中，IGF2BP3敲除后，HK3的表達下調，并通過過表達circZBTB44而被逆轉（圖5I）。

圖5 CircZBTB44與IGF2BP3相互作用調節HK3 mRNA的穩定性。

6、HK3在體外和體內均促進RCC的生長和轉移
       作者研究了HK3對RCC細胞發生的影響。qRT-PCR和western blot分析顯示，轉染si-HK3-1/-2/-3后，RCC細胞中HK3的表達顯著降低（圖6A）。研究表明，HK3敲低可顯著抑制RCC細胞的生存能力和增殖能力（圖6B-C）。此外，相對于對照組，si-HK3-1和si-HK3-2組的RCC細胞遷移能力顯著降低（圖6D-E）。利用荷瘤小鼠模型評估HK3缺乏對RCC腫瘤發生的影響，qRT-PCR和western blot分析顯示，sh-HK3組小鼠腫瘤組織中HK3的表達明顯下調（圖6F-G）。與對照組相比，缺乏HK3導致小鼠腫瘤重量和體積顯著減少（圖6H-I）。此外，小鼠腫瘤組織中的Ki67蛋白因HK3缺乏而減少，這表明HK3敲低抑制了體內RCC的腫瘤發生（圖6J）。

圖6 HK3在體外和體內均促進RCC的生長和轉移

7、CircZBTB44通過上調HK3促進RCC生長和轉移
       作者進行了救援試驗，以檢驗HK3是否在circZBTB44對RCC進展的調節中發揮作用。利用pcDNA3.1/ HK3載體過表達HK3，通過qRT-PCR驗證轉染效率（圖7A）。作者發現circZBTB44誘導RCC細胞活力下降，并且HK3過表達后EdU陽性細胞比例明顯恢復（圖7B-C）。沉默circZBTB44后，遷移的RCC細胞數量和RCC細胞的傷口愈合距離減少，發現這與HK3上調相抵消（圖7D-E）。此外，circZBTB44缺失誘導的異種移植物腫瘤重量、體積和生長速度的下降被HK3過表達顯著逆轉（圖7F-G）。與sh-circ+oe-NC組相比，circZBTB44敲低組小鼠腫瘤組織中Ki67蛋白表達降低，HK3過表達升高（圖7H）。

圖7 CircZBTB44通過上調HK3促進RCC生長和轉移

8、CircZBTB44通過上調HK3促進巨噬細胞M2極化
       前人研究表明，HK3通過刺激浸潤的單核細胞或巨噬細胞表面標記物的豐度，促進RCC細胞的免疫逃逸。因此，作者探索circZBTB44是否通過調節HK3來調節單核細胞或巨噬細胞的M2極化。M0巨噬細胞與RCC細胞共培養誘導TAMs （圖8A）。流式細胞術顯示，circZBTB44沉默顯著降低了CD86⁺CD206^?巨噬細胞的比例，升高了CD206+CD86?巨噬細胞的比例，這一現象被HK3過表達逆轉（圖8B）。在與RCC共培養的巨噬細胞中檢測M1相關基因（CD86、TNF-α）和M2相關基因（CD206、ARG-1）的表達。結果顯示，circZBTB44沉默降低了CD206和ARG-1的表達，增加了CD86和TNF-α的水平，而HK3過表達可顯著拯救CD206和ARG-1的表達（圖8C-D）。

圖8 CircZBTB44通過上調HK3促進巨噬細胞M2極化

實驗方法
       生物信息學分析，RNase R消化實驗，qRT-PCR，Western blot，Rescue assays，RNA干擾，過表達，細胞遷移實驗，細胞劃痕實驗，EdU化驗，細胞活力測定，免疫熒光染色，熒光原位雜交（FISH），甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP），免疫組化（IHC），RNA pull-down，GST pull-down，RNA免疫沉淀（RIP），異種移植小鼠模型，RCC細胞與巨噬細胞共培養，流式細胞術。
參考文獻：
Li TS, Gu Y, Xu BC, Kuca K, Zhang J, Wu WD. CircZBTB44 promotes renal carcinoma progression by stabilizing HK3 mRNA structure. 2023, April, 22（1）: 77. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01771-5.