ZBP1可預防mtDNA誘導的衰竭心臟的心肌炎癥
欄目：最新研究動態
發布時間：2023-08-23
ZBP1（Z-DNA 結合蛋白1）是一種模式識別受體，可響應炎癥細胞、成纖維細胞和內皮細胞中的mtDNA 而積極調節炎癥......
心力衰竭（HF）的患病率和發病率正在上升，并被定義為一種全球大流行，影響全球約26萬人。盡管治療取得了重大進展，但HF的發病率和死亡率仍然很高。因此，需要對HF的病理生理學和分子機制有新的見解來開發新的治療方法。線粒體DNA（mtDNA）誘導的心肌炎癥與心臟重塑密切相關。ZBP1（Z-DNA 結合蛋白1）是一種模式識別受體，可響應炎癥細胞、成纖維細胞和內皮細胞中的mtDNA 而積極調節炎癥。然而，ZBP1在心肌炎癥和心臟重塑中的作用尚不清楚。該研究發表于《Circulation Research》，IF：23.213。
技術路線：
主要研究結果：
1. mtDNA增加ZBP1并激活心肌細胞中的炎癥信號傳導
為了評估心肌細胞中ZBP1對mtDNA的表達，作者將1000ng / mL從大鼠肝臟中提取的mtDNA施用到心肌細胞中，通過檢測mtDNA的一部分Cox1而不是核DNA的一部分At3來驗證其純度（圖1A）。從mtDNA給藥24小時后，作者發現ZBP1 mRNA和蛋白質水平增加（圖1B和1C）隨著IL-1β和IL-6 mRNA水平的增加（圖1D）。
此外，作者研究了ZBP1和其他與炎癥相關的蛋白質的mtDNA劑量依賴性反應，包括微管相關蛋白1A / 1B- LC3（輕鏈3），RIPK3，磷酸化的NF-κB p65亞基（Ser536）和NLRP3。雖然低劑量的mtDNA（100 ng/mL）增加了LC3-II，但沒有增加ZBP1，但高劑量的mtDNA（1000 ng/mL）增加了LC3-II和ZBP1（圖1E和1F）。重要的是，只有高劑量的mtDNA才能增加RIPK3，磷酸化的NF-κB，NLRP3和磷酸化TBK1的蛋白質水平，它們是炎癥的主要介質（圖1F）。此外，高劑量的mtDNA增加了IL-1β和IL-6的mRNA水平，而低劑量則沒有（圖1G）。這些數據表明，雖然低劑量的mtDNA通過自噬激活和處理，如LC3-II的增加所證明的那樣，高劑量的mtDNA不僅誘導自噬，而且還增加ZBP1和其他炎癥相關蛋白，導致心肌炎癥。
圖1 mtDNA增加ZBP1并激活心肌細胞中的炎癥信號傳導
2. ZBP1敲低加劇了用mtDNA處理的心肌細胞中炎癥細胞因子的增加
接下來，作者研究了ZBP1在心肌細胞中響應1000 ng / mL mtDNA的功能作用。小干擾RNA敲低有效抑制了ZBP1的mRNA和蛋白質水平（圖2A和2B）。出乎意料的是，盡管ZBP-1已被報道介導炎癥，但ZBP1敲低加劇了mtDNA誘導的RIPK3，磷酸化NF-κB和NLRP3的增加（圖2B）。與這些結果一致，ZBP1敲低進一步增加了用mtDNA處理的心肌細胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平（圖2C）。TBK1是ZBP1的另一個下游靶標。盡管高劑量的mtDNA增加了TBK1的磷酸化（圖1F），ZBP1敲低沒有影響它（圖2D）。這些發現表明，ZBP1負調節心肌細胞中的RIPK3，NF-κB和炎性細胞因子，但不是TBK1。
圖2 ZBP1敲低會加劇用mtDNA處理的心肌細胞中炎性細胞因子的增加
3. 在mtDNA處理的心肌細胞中，敲低RIPK3可通過敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3軸的增加
為了研究ZBP1和RIPK3之間的關系，并闡明RIPK3是否可以介導炎癥作為ZBP1的下游靶標，作者進行了ZBP1和RIPK3的雙重敲低實驗。雙敲低有效降低了這些蛋白質（圖3A）。重要的是，RIPK3敲低減弱了mtDNA處理的心肌細胞中ZBP3敲低磷酸化NF-κB和NLRP1增加的惡化（圖3A）。RIPK3敲低也降低了IL-1β和IL-6的mRNA水平（圖3B）。這些發現表明RIPK3正調控NF-κB和NLRP3，ZBP1通過抑制RIPK3發揮抗炎作用。相反，mtDNA和ZBP1敲低都不影響細胞存活（圖3C），表明ZBP1-RIPK3軸不能直接調節心肌細胞死亡。
圖3在mtDNA處理的心肌細胞中，敲低RIPK3可通過敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3軸的增加
4. 在mtDNA處理的心肌細胞中，敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3軸的增加
接下來，作者研究了NF-κB是否可以介導炎癥作為ZBP1的下游靶標。作者發現NF-κB敲低減輕了mtDNA處理的心肌細胞中ZBP3敲低NLRP3增加的惡化，但不能減輕RIPK1的惡化（圖4A）。重要的是，這些變化伴隨著IL-1β和IL-6的mRNA水平的降低（圖4B）。綜上所述，這些數據表明ZBP1通過抑制NF-κB途徑發揮抗炎作用。
圖4 在mtDNA處理的心肌細胞中，敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3軸的增加
5. ZBP1負調節CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細胞中的炎癥反應
眾所周知，ZBP1可以感知線粒體和核DNA。為了鑒定刺激心肌細胞中ZBP1的DNA類型，作者使用了模擬mtDNA的CpG-寡脫氧核苷酸和模擬核DNA的對照寡脫氧核苷酸。作者發現異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CpG-寡脫氧核苷酸與mcherry標記的ZBP1共定位（圖5A）。5CpG-寡脫氧核苷酸增加ZBP1 mRNA和蛋白質水平（圖5B和5C）和ZBP1敲低進一步增加了用CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平（圖5D）。這些發現表明，ZBP1可以感知心肌細胞中的線粒體和核DNA，并負向調節炎癥以響應它們。
圖5 ZBP1和CpG-ODN的相互作用參與ZBP1在CpG-ODN處理的心肌細胞中的抗炎作用
6. TLR9 敲低通過抑制 RIPK3、NF-κB 和 NLRP3 來改善 mtDNA 或 CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細胞中的炎癥反應
接下來，作者試圖研究mtDNA處理的心肌細胞中TLR9，ZBP1和RIPK3之間的關系。CpG-寡脫氧核苷酸，也稱為TLR9刺激劑，被發現增加心肌細胞中的RIPK3表達（圖5E），表明RIPK3是TLR9的下游。作者證實TLR9敲低有效地降低了其mRNA水平（圖5F）。此外，作者發現TLR9敲低增強了mtDNA誘導的心肌細胞中ZBP1 mRNA和蛋白質水平的增加（圖5G和5H）和加劇的CpG-寡脫氧核苷酸誘導的ZBP1增加（圖5I）。這些數據表明ZBP1阻礙了mtDNA和TLR9之間的相互作用，從而預防了下游炎癥信號傳導。
7. 心肌梗死后衰竭心臟的ZBP1和胞質mtDNA增加
為了評估ZBP1在衰竭心臟中的作用，作者在小鼠中進行了MI的體內實驗。作者在MI模型中驗證了梗死。作者發現，心肌梗死術后1天，心肌梗死后心臟非梗死區域的ZBP3蛋白水平升高（圖6A）。接下來，作者分析了MI模型中胞質部分的DNA水平。作者對GAPDH、線粒體標志物COX4和自噬標志物LC3進行了免疫印跡驗證了胞質組分的純度（圖6B）。Dloop是mtDNA的一種成分，在細胞溶質部分中在對照心臟中大量檢測到，并在MI后心臟中增加（圖6B）。相反，核DNA的組成部分Tert和B2m在對照和心肌梗死后心臟中均略有檢測到（圖6B）。總體而言，這些數據表明ZBP1與衰竭心臟中胞質mtDNA的增加有關。
圖6 ZBP1敲除通過 RIPK3-NF-κB-NLRP3途徑增強衰竭心臟的心肌炎癥
8. ZBP1 敲除加劇心功能不全和心肌梗死后重塑
ZBP1基因敲除小鼠在心肌梗死后左心室（LV）舒張和收縮壓直徑增加，左心室射血分數降低，心臟衰竭部分縮短（圖7A）。ZBP1敲除也加劇了全心重和左心室體重的增加（圖7B）。在病理分析中，ZBP1敲除增強了衰竭心臟的膠原蛋白體積，這是心臟纖維化的指標，但不是橫截面積，心肌細胞肥大的指數（圖7C）。這些數據表明，ZBP1 敲除會加劇心肌梗死后的心功能不全和重塑。
圖7 ZBP1敲除會加劇心肌梗死后的心功能障礙和重塑
結論：
ZBP1作為RIPK3-NF-κB通路的心肌炎癥內源性抑制因子，在心臟重塑中起保護作用。旨在通過ZBP1干擾心肌炎癥的治療策略可能有助于預防心臟重塑和衰竭。
示意圖：
ZBP1在心肌炎癥和重塑中的作用示意圖
實驗方法：
細實時聚合酶鏈反應，免疫印跡，細胞活力檢測，動物實驗
參考文獻：
Enzan N, Matsushima S, Ikeda S, Okabe K, Ishikita A, Yamamoto T, et al. ZBP1 Protects Against mtDNA-Induced Myocardial Inflammation in Failing Hearts. Circ Res. 2023 Apr 28;132(9):1110-1126.