缺血再灌注損傷(IRI)是急性腎損傷(AKI)的主要原因之一，實(shí)驗(yàn)工作揭示了腎臟炎癥反應(yīng)的詳細(xì)情況。T細(xì)胞和NFκB通路在IRI中起重要作用。因此，我們?cè)贗RI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒芯苛薎KK1在CD4+T淋巴細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。CD4cre和CD4IKK1Δ小鼠誘導(dǎo)IRI。與對(duì)照組小鼠相比，CD4+T淋巴細(xì)胞中IKK1的條件缺失顯著降低了血清肌酐、血尿素氮（BUN）水平和腎小管損傷評(píng)分。在機(jī)制上，CD4+T淋巴細(xì)胞中IKK1的缺失降低了CD4淋巴細(xì)胞向Th1/Th17細(xì)胞分化的能力。與IKK1基因消融類似，IKK的藥理抑制也能保護(hù)小鼠免受IRI。總之，淋巴細(xì)胞IKK1通過促進(jìn)T細(xì)胞分化為Th1/Th17在IRI中發(fā)揮關(guān)鍵作用，靶向淋巴細(xì)胞IKK1可能是IRI的一種新的治療策略。本文于2023年4月發(fā)表于“Cellular and Molecular Life Sciences”（IF=9.207）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：
1）IRI后腎臟中NFκB通路的激活
       為了驗(yàn)證IRI期間腎臟中NFκB通路的激活，我們查詢了在IRI后2h、4h、24h、48h、72h、7d、14d和28d時(shí)間點(diǎn)收集的小鼠腎臟大量RNA數(shù)據(jù)集(GSE98622)以及相應(yīng)的假手術(shù)小鼠腎臟對(duì)照RNA，以檢測(cè)9種NFκB激活基因的表達(dá)水平(NFκB激活評(píng)分)。與假手術(shù)組相比，IRI誘導(dǎo)后超過2h的所有時(shí)間點(diǎn)NFκB激活評(píng)分均上調(diào)(圖1A, B)。此外，當(dāng)我們對(duì)IRI后腎臟中Nfkb1、Nfkb2和Relb的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析時(shí)，這些基因的表達(dá)在IRI誘導(dǎo)后也顯著增加(圖1C)。
       為了捕獲IRI的腎細(xì)胞和腎CD4+T細(xì)胞景觀，我們?cè)贗RI發(fā)生2天后整合了全小鼠腎臟在線單核RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集(GSE139107)和CD4+T細(xì)胞單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集(E-MTAB-8002)(圖2A)。無監(jiān)督聚類識(shí)別出IRI誘導(dǎo)后腎臟中的14個(gè)腎細(xì)胞簇和1個(gè)CD4+T細(xì)胞簇，包括上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞。我們?cè)u(píng)估了所有細(xì)胞群中的NFκB激活評(píng)分，發(fā)現(xiàn)與所有細(xì)胞群相比，T細(xì)胞中的NFκB激活評(píng)分顯著上調(diào)(圖2B)。接下來，我們更精確地分析了IRI后2天的CD4+T細(xì)胞數(shù)據(jù)集(E-MTAB-8002)，并與對(duì)照小鼠的CD4+T細(xì)胞整合。通過無監(jiān)督聚類，我們確定了9個(gè)細(xì)胞群，包括Th1_1、Th1_2、Th2、Th17、Tnai (na?ve T細(xì)胞)、Tcm(中樞記憶T細(xì)胞)、Treg(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)、Prolif(增殖T細(xì)胞)和ISAG (IFN信號(hào)相關(guān)基因高表達(dá)T細(xì)胞)(圖2C)。為了剖析IRI對(duì)腎臟中CD4+T細(xì)胞組成的影響，我們比較了對(duì)照小鼠和IRI小鼠的CD4+T細(xì)胞亞群(圖2D)。結(jié)果表明，Th17群體在炎癥腎臟中更為豐富，表明該群體可能是IRI早期的重要致病因素。綜上所述，這促使我們假設(shè)CD4+T細(xì)胞中NFκB的激活有助于IRI的發(fā)病機(jī)制。

2）CD4+T細(xì)胞中的IKK1驅(qū)動(dòng)IRI
       為了研究腎炎癥過程中NFκB激活在CD4+T細(xì)胞中的功能作用，我們通過CD4cre與相應(yīng)的flox小鼠雜交，特異性刪除了激活CD4+T細(xì)胞中NFκB通路的關(guān)鍵分子IKK1(Chuk)、IKK2(Ikbkb)、NEMO(Ikbkg)和NIK(Map3k14)。與對(duì)照小鼠相比，CD4IKK1Δ小鼠的血尿素氮(BUN)水平和肌酐水平(功能性腎損害的代表性標(biāo)志物)顯著降低，而CD4IKK2Δ、CD4NEMOΔ和CD4NIKΔ小鼠則無顯著差異(圖3A、B)。此外，腎臟切片的形態(tài)學(xué)評(píng)估也顯示CD4IKK1Δ小鼠腎小管損傷顯著降低，而其他組則無顯著差異(圖3C、D)。在CD4IKK1Δ小鼠中，腎臟Nfkb1和Nfkb2基因表達(dá)也顯著降低，這表明在CD4IKK1Δ小鼠中，NFκB通路的激活發(fā)生了顯著變化(圖3E)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，CD4+T細(xì)胞中的IKK1是IRI中腎組織損傷的主要驅(qū)動(dòng)因素。

3）藥理抑制IKK1可保護(hù)小鼠IRI
       關(guān)于IKK1在IRI中的致病作用及其對(duì)CD4+T細(xì)胞分化過程的重要性，我們研究IKK1的藥物阻斷是否可以減輕腎損害。因此，我們?cè)贗RI誘導(dǎo)前后用IKK1/IKK2抑制劑KINK-1治療小鼠，阻斷IKK1的激活。(圖4A)。誘導(dǎo)IRI后，與載藥治療相比，IKK1抑制降低了腎損傷的嚴(yán)重程度(圖4B，4C)。

4）IKK1促進(jìn)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子
       為了研究IKK1對(duì)IRI后腎CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，我們對(duì)浸潤(rùn)腎臟的免疫細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)。基于流式細(xì)胞術(shù)的CD4cre和CD4IKK1Δ小鼠的白細(xì)胞染色顯示，IRI誘導(dǎo)2天后，腎臟浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中約40%是CD4+T細(xì)胞(圖5A)。細(xì)胞因子染色結(jié)果顯示，IRI誘導(dǎo)后，CD4IKK1Δ小鼠的IFN-γ和IL-17A的產(chǎn)生均增加，此外，與CD4cre小鼠相比，CD4IKK1Δ小鼠中這兩種細(xì)胞因子的產(chǎn)生均顯著減少(圖5B, C)。綜上所述，IKK1對(duì)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化具有主要的致病作用。

5）IKK1驅(qū)動(dòng)CD4+T細(xì)胞的Th17和Th1/Th2分化
       為了進(jìn)一步探索淋巴樣IKK1在IRI中致病作用的機(jī)制，我們進(jìn)行了大量RNA測(cè)序，分析了IRI后CD4cre或CD4IKK1Δ小鼠腎CD4+T細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄組譜。從基因表達(dá)譜和整體表達(dá)相似性來看，各組個(gè)體重復(fù)具有高度同源性(圖6A)。共識(shí)別248個(gè)DEG，其中下調(diào)基因228個(gè)，上調(diào)基因20個(gè)(圖6B)。在下調(diào)的基因中，大多數(shù)與炎癥相關(guān)，并富集KEGG術(shù)語“Th1和Th2細(xì)胞分化”、“Th17細(xì)胞分化”和“炎癥性腸病”(圖6C)，而上調(diào)基因大多富集“ECM受體相互作用”、“凋亡”和“軸突引導(dǎo)”(圖6D)。在“Th1/ Th2細(xì)胞分化”和“Th17細(xì)胞分化”中，Tbx21、Il2ra、Il17a和H2-Ab1的富集也符合對(duì)NFκB如何調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的理解(圖6E)。對(duì)腎臟Ifng、Tbx21、Cxcr3、Il17、Rorc和Ccr6基因表達(dá)的RT-PCR分析也證實(shí)了IRI后炎癥腎臟中Th1和Th17的分化依賴于IKK1(圖7)。綜上所述，IKK1通過影響CD4+T細(xì)胞的分化在IRI中起著重要的致病作用，抑制CD4+T細(xì)胞中的IKK1可減輕IRI損傷。

結(jié)論
       IKK1的抑制可以通過影響NFκB通路的激活來抑制CD4+T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化的能力，從而降低IRI損傷的程度。
實(shí)驗(yàn)方法
       PAS染色，流式，qPCR，RNA測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序。
參考文獻(xiàn)
Song N, Xu Y, Paust HJ, Panzer U, de Las Noriega MM, Guo L, Renné T, Huang J, Meng X, Zhao M, Thaiss F. IKK1 aggravates ischemia-reperfusion kidney injury by promoting the differentiation of effector T cells. Cell Mol Life Sci. 2023 Apr 19;80(5):125. doi: 10.1007/s00018-023-04763-2.