免疫組織化學，免疫熒光，流式細胞術，轉錄組學分析，動物實驗

       腫瘤相關抗原硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4）是一種高度糖基化的跨膜蛋白聚糖。盡管在一些正常組織中中報道了CSPG4表達，CSPG4在幾種實體瘤中過表達，包括惡性黑色素瘤、乳腺癌亞群、間皮瘤和神經母細胞瘤。因此CSPG4被認為是癌癥靶向免疫療法的有希望的靶標。幾種CSPG4靶向療法已在臨床前和臨床研究中進行了評估，顯示初步療效和良好的安全性。盡管檢查點抑制劑抗體免疫療法的批準取得了實質性進展，但晚期疾病的 5 年生存率仍然很低（< 55%）。許多患者的腫瘤對現有的免疫和靶向治療沒有反應，或者獲得性耐藥性迅速發展。因此，針對黑色素瘤相關抗原（如CSPG4）的免疫療法可以有效地引導免疫細胞對抗癌癥并解決重大未滿足的需求。靶向黑色素瘤相關抗原的 IgE 類抗體尚未得到評估。該研究發表于《Nature Communications》，IF：17.694。

技術路線：

主要研究結果：
1. CSPG4在惡性黑色素瘤組織中的過表達，以及CSPG4 IgE的工程和表征
       公開數據集的轉錄組學分析證實，在幾種腫瘤細胞系（每種癌癥類型n = 4-8）和人類癌癥組織（每種癌癥類型n = 127-102）中，與其他腫瘤類型相比，黑色素瘤中CSPG1075基因表達水平顯著更高（圖1a，b），以及皮膚黑色素瘤（n = 461）與正常皮膚（n = 558）組織相比（圖1c）。此外，在原發性和轉移性疾病（皮膚、內臟和淋巴結轉移）中測量CSPG4基因表達（圖1d，左，n = 36-208），以及黑色素瘤的所有階段（圖1d，右）。使用小鼠抗人CSPG4抗體（通過堿性磷酸酶（AP，粉紅色）檢測）在人黑色素瘤中的免疫組織化學（IHC）評估（n = 428，圖1e），和幾個正常組織（n = 389）表明在4%的惡性黑色素瘤中可檢測到CSPG63蛋白表達（n = 428，圖1l）。

圖1 CSPG4在惡性黑色素瘤和正常組織中的表達

       先前已經報道了同類首創的MOv18 IgE的抗腫瘤功能，并指出IgE參與腫瘤微環境（TME）中表達Fcε受體的免疫效應細胞（如單核細胞和巨噬細胞）的參與和重編程。作者從CSPG4特異性克隆中生成了具有人IgE恒定結構域和小鼠可變區域的單克隆抗體（圖2a）。親和純化的CSPG4 IgE顯示出與MOv18（FRαIgE）相當的生物物理特性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在還原和非還原條件下，以及體積排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）證實了亞基組成和分子量與等效IgE一致的單分散產物，純度通常高于95%（圖2b）。
       流式細胞術和IHC分析（圖2c-f）證明了CSPG4 IgE與已知表達人CSPG4的人黑色素瘤細胞系的劑量依賴性結合（A2058，A375，WM1366）。正如預期的那樣，作者沒有檢測到與IGROV1卵巢或SKBR3乳腺癌細胞的結合（圖2c）。與FRα IgE相比，CSPG4 IgE與表達FcεRI的大鼠嗜堿性白血病細胞（RBL-SX38）結合（圖2c，右）。根據使用商業小鼠抗體克隆的IHC評估，CSPG4 IgE顯示所有惡性黑色素瘤的陽性染色率為~70-75%（n = 468），當分為皮膚病變，淋巴結和遠處轉移時（n = 302）。良性痣（n = 18）顯示CSPG4 IgE檢測到低/中等CSPG4表達（圖2d，e，左），CSPG4表達在黑色素瘤的所有階段都保持不變（圖2e，右）。與正常人體組織的結合（n = 297）為陰性或低，除了大腦、消化、內分泌、眼睛和女性生殖組織，其中在一定比例的組織中觀察到低或中等CSPG4表達（圖2l）。
       因此，在惡性黑色素瘤中檢測到CSGP4表達，并且在正常組織中表現出低且有限的分布。嵌合CSPG4 IgE和小鼠抗人CSPG4克隆通過IHC顯示出與人體組織的相當結合，并識別出表達CSPG4的黑色素瘤細胞。

圖2 CSPG4 IgE 的生成、生物物理表征和癌癥特異性

2. CSPG4 IgE可發揮體外抗腫瘤功能

       接下來，作者評估了CSPG4 IgE的潛在抗腫瘤功能。作者分析了CSPG4在人黑色素瘤細胞系（A375，A2058，WM1366，WM115，WM1361，G361和SKMEL28）中與未知表達CSPG4的細胞（IGROV1卵巢和SKBR3乳腺癌細胞以及原代非惡性黑色素細胞）中的相對表達（圖3a）。
       此前有報道稱，CSPG4及其下游信號通路在黑色素瘤細胞中的高表達可能有助于腫瘤進展1,35.由于Fab介導和Fc介導的針對腫瘤細胞的抗腫瘤IgE抗體的效應功能可能會限制癌細胞的生長，作者研究了CSPG4 IgE是否會在體外損害癌細胞功能。首先，作者研究了在沒有交聯或效應細胞的情況下，作者的抗體對癌細胞功能的Fab介導的直接影響。與非特異性同種型對照相比，CSPG375 IgE部分抑制了A4細胞粘附，遷移和侵襲（圖3b）。此外，CSPG4 IgE通過其Fc結構域與RBL-SX38細胞結合并通過多克隆抗IgE交聯可以觸發細胞脫顆粒（通過β-己糖胺酶釋放測量），類似于陽性對照交聯半抗原特異性（NIP）IgE。在存在高CSPG4表達的A4和A375黑色素瘤細胞的情況下，CSPG2058 IgE比非特異性同種型對照NIP IgE引發的脫顆粒明顯更大（圖3c）。
       CSPG4 IgE 通過健康志愿者和黑色素瘤患者來源的外周血單核細胞 （PBMC） 觸發了高于同種型對照 IgE 的 A2058 和 A375 黑色素瘤細胞的顯著抗體依賴性細胞毒性 （ADCC）（圖3d，分別為左和右）和人單核細胞U937細胞（圖3e）。通過流式細胞術證實CSPG4與原代人單核細胞上未占用的Fc?受體I（Fc?RI）結合（圖3l，左）。CSPG4 IgE 介導的 A375 和 A2058 黑色素瘤細胞的 ADCC 由來自兩個健康參與者的單核細胞觸發（圖3l，右）和黑色素瘤患者（圖3g）。總之，這些發現表明ADCC功能依賴于靶細胞的抗原表達。
       與非特異性IgE相比，CSGP4 IgE對黑色素瘤細胞具有直接影響，并利用人類健康志愿者和黑色素瘤患者來源的效應細胞觸發體外效應器功能，腫瘤細胞細胞毒性和脫顆粒。

圖3 CSPG4 IgE體外的抗腫瘤和Fc介導的效應功能

3. CSPG4 IgE 介導的人單核細胞上清液中免疫介質的上調和單核細胞中促炎細胞表面標志物的表達顯著增加
       先前的研究表明，IgE刺激免疫效應細胞（如卵巢癌患者單核細胞）可能會增強促炎信號。在這里，作者旨在評估CSPG4 IgE和黑色素瘤的這些功能。在健康的志愿者和黑色素瘤患者中，作者調查了血液；IgE 滴度（分別為 n = 38 和 n = 13）和 PBMC 內單核細胞的總體比例（分別為 n = 25 和 n = 44）和表達高親和力 IgE Fc 受體 Fc?RI 的單核細胞的比例（分別為 n = 25 和 n = 46）。作者發現這些參數中的任何一個都沒有顯著差異（圖4a，左三張圖）。同樣，在評估健康志愿者和黑色素瘤患者血清中的趨化因子和細胞因子譜時，TNF，IL-10，IL-1β，IL-4，GM-CSF，IL-13，M-CSF，VEGF，PDGFA和TGFβ2中沒有顯著差異，而黑色素瘤隊列中的TGFβ1水平顯著更高（圖4a，右圖）。
Fc?RI結合的CSPG4 IgE與多克隆抗IgE交聯以模擬人單核細胞U937細胞表面的免疫復合物形成，導致TNF上調（圖4b），與先前的發現一致。隨后，在用CSPG4 IgE刺激的人單核細胞的上清液中（圖4c），與單獨給予IgE的細胞相比，當CSPG1 IgE交聯時，作者檢測到分泌的TNF，IL-6β，IL-2和CCL-1 / MCP-4顯著增加，而IL-4和IL-23滴度沒有觀察到顯著差異。單核細胞表面標志物的流式細胞術分析（圖4d）表明，與單獨給予IgE的細胞相比，IgE交聯導致共刺激和活化分子CD80，CD86，PD-L1，CD40和HLA-DR的表達顯著增加，并且清除受體CD163和CCR2的表達降低。與非特異性IgE對照共培養物相比，在與表達CSPG4的A4癌細胞共培養物中，以抗原特異性方式與原代單核細胞結合的CSPG2058 IgE的交聯也引發了TNF，CCL-2 / MCP-1，IL-10和IL-6的分泌顯著增加，但IL-4和IL-23的分泌沒有增加（圖4e）。
       人單核細胞表面CSPG4 IgE的交聯顯著增加了促炎細胞因子和共刺激細胞表面標志物的產生和表達。

圖4 人單核細胞表面CSPG4 IgE的交聯促進促炎細胞因子的分泌并增強共刺激細胞表面標志物的表達

4. CSPG4 IgE 限制體內黑色素瘤腫瘤生長
       作者研究了CSGP4 IgE是否可以限制免疫缺陷（NOD / scid / IL-2R γ-/?）小鼠體內人類黑色素瘤的生長。由于人IgE不與表達FcεR的小鼠免疫細胞發生反應，因此將小鼠移植健康志愿外周血免疫細胞，并用A375黑色素瘤細胞皮下攻擊（圖5a）。30天后切除的腫瘤保留CSPG4表達（圖5b）。與IgE同種型對照和相應的CSPG4 IgG治療相比，每隔4天或7天給予CSPG14 IgE顯著限制了小鼠皮下人黑色素瘤異種移植物的生長（圖5c）。
與先前抗FRα IgE的體內評估一致11,13，切除腫瘤的免疫組織化學分析顯示，與給予同種型對照IgE或CSPG45 IgG的小鼠腫瘤相比，用CSPG68 IgE治療的小鼠腫瘤中人CD4白細胞浸潤，CD4巨噬細胞浸潤顯著更高（圖5d）。

圖5 CSPG4 IgE治療可以限制腫瘤生長，并在移植有健康志愿免疫細胞的皮下A375體內模型中誘導人免疫細胞浸潤

       為了深入了解與IgE抗體治療效果相關的免疫途徑，對這些體內實驗結束時檢索到的黑色素瘤樣品進行了基因表達分析。與對照組相比，在CSPG4 IgE處理動物的表達CSPG4的異種移植物中觀察到單核細胞和巨噬細胞基因特征的表達增強（圖6a）。根據倍數變化對Reactome內基因集的富集進行排名（圖6b）。轉錄組學分析揭示了IgE治療組中富集的幾種免疫信號通路，包括Fc?RI，TNF受體，干擾素，白細胞介素-1和-12，抗原呈遞相關通路和MHC I / II類呈遞（圖6c）。這些發現與單核細胞和巨噬細胞的潛在活性以及促炎信號一致，包括TNF產生升高，這也與CSPG4 IgE刺激人單核細胞離體觀察到（圖4c，e），并在用CSPG4 IgE靜脈內治療的小鼠的黑色素瘤異種移植物中浸潤人免疫細胞（圖5d）。

圖6單核細胞和巨噬細胞特征，以及 Fc? 受體和促炎免疫途徑的激活，在體內進行 CSPG4 IgE 治療

       為了進一步評估CSPG4 IgE在限制黑色素瘤傳播方面的作用，通過尾靜脈用A375黑色素瘤細胞攻擊移植了健康志愿者外周血免疫細胞的小鼠，導致肺部病變的形成。與對照組IgE相比，28天后切除的肺顯示每肺黑色素瘤病變數量顯著降低，并且CSPG4 IgE的肺部腫瘤占用百分比呈降低趨勢（圖7a）。為了評估CSPG4 IgE是否可以限制患者免疫細胞背景下黑色素瘤的生長，移植黑色素瘤患者來源免疫細胞的小鼠接受了皮下A375人黑色素瘤的挑戰。與無抗體或非特異性同種型IgE對照組相比，靜脈注射CSPG29 IgE治療的小鼠黑色素瘤異種移植重量（腫瘤激發后4天）顯著降低（圖7b，左）。同樣，與PBS和同種型對照IgE組相比，用CSPG4 IgE治療的小鼠的腫瘤生長受到顯著限制（圖7b，右）。在PBS和同種型對照IgE處理的動物之間測量腫瘤重量或腫瘤體積沒有統計學上的顯著差異（圖7b）。此外，為了研究CSPG4 IgE限制患者來源黑色素瘤生長的潛力，小鼠移植了來自兩個III期和IV期皮膚黑色素瘤轉移個體的患者來源的皮膚黑色素瘤腫瘤異種移植物（PDX），并移植了來自同一患者的自體外周血淋巴細胞（PBL）。與對照組相比，每周靜脈注射CSPG4 IgE治療與顯著延長的生存期相關（圖7c）。
       因此，在移植有健康志愿者或黑色素瘤患者免疫細胞的免疫缺陷小鼠和用自體患者免疫細胞重組的PDX小鼠中，不同的體內黑色素瘤模型與對照組相比，CSPG4 IgE與顯著的腫瘤生長限制或生存率提高有關。CSPG4 IgE在體內的療效與腫瘤中CD68巨噬細胞的顯著浸潤以及轉錄組水平上Fc?受體和幾種促炎免疫途徑的顯著激活有關。

圖7 CSPG4 IgE在A375和PDX腫瘤模型中的療效

5. 對CSPG4 IgE的潛在I型超敏反應的體外和離體評估
       為了初步了解與IgE相關的I型超敏反應風險，作者詢問了CSPG4 IgE是否可以增強患者來源的循環嗜堿性粒細胞的脫顆粒作用。首先，在RBL-SX4脫顆粒模型中測試了CSPG38 IgE在存在健康和患者血清的情況下觸發脫顆粒的潛力。雖然NIP IgE（陽性對照）通過其特異性多聚體抗原（NIP-BSA）的交聯引發了顯著的脫顆粒，但與來自健康志愿者（n = 4）和黑色素瘤患者（n = 16）的血清一起與CSPG15 IgE孵育時，背景以上沒有引發脫顆粒（圖8a）。此外，使用嗜堿性粒細胞活化試驗（BAT）在黑色素瘤患者的全普通血液中研究了IgE離體對原代人嗜堿性粒細胞的潛在活化（圖8b-d）。該測定用于測試對藥物和過敏原過敏的可能性。用已知的嗜堿性粒細胞活化刺激孵育患者血液;非IgE介導的fMLP，IgE介導的抗FcεRI和抗IgE，以及NIP IgE與NIP-BSA一起觸發SSC的激活低CCR3高嗜堿性粒細胞（通過增加CD63細胞表面表達來測量）（圖8c）。CSGP4 IgE和非CSPG4對照IgE在黑色素瘤患者的全血樣本中離體孵育時都不會觸發嗜堿性粒細胞活化（n = 15）（圖8d）。
       CSPG4 IgE在存在患者血清的情況下未誘導RBL-SX38細胞脫顆粒，并且未激活黑色素瘤患者全血中的嗜堿性粒細胞。這些發現為患者血清和血液中缺乏CSPG4 IgE離體嗜堿性粒細胞活化的早期信號提供了初步指示。

圖8 CSPG4 IgE 在患者或健康參與者存在人血清的情況下不介導 RBL-SX38 細胞脫顆粒，也不會觸發癌癥患者離體血液中的嗜堿性粒細胞活化

結論：
       總之，該研究表明，CSPG4 IgE介導的抗腫瘤活性來自健康志愿者和黑色素瘤患者的免疫細胞對表達CSPG4的人黑色素瘤細胞。CSPG4 IgE治療限制了不同體內模型中的腫瘤生長或生存率的提高，無論腫瘤部位如何，并且植入健康志愿者或患者的免疫細胞。作者還證明CSPG4 IgE增加了巨噬細胞腫瘤浸潤，并與幾種促炎免疫途徑的激活有關。這些細胞和促炎信號傳導先前已在臨床前被描述為對IgE療法的穩健抗腫瘤活性很重要。最后，離體BAT提供了對CSPG4 IgE不存在I型超敏反應的初步證據，盡管其在臨床環境中的應用尚未確定。這些有希望的發現可能對治療不同的實體瘤具有深遠的益處，特別是那些缺乏批準的癌癥靶向抗體療法的實體瘤。

示意圖：

參考文獻：
Chauhan J, Grandits M, Palhares LCGF, et al. Anti-cancer pro-inflammatory effects of an IgE antibody targeting the melanoma-associated antigen chondroitin sulfate proteoglycan 4. Nat Commun. 2023 Apr 25;14(1):2192.