自噬在肌肉的質(zhì)量、功能和完整性上發(fā)揮著核心作用。調(diào)節(jié)自噬的分子機制很復雜，目前有很多未知性待挖掘。在本文中，作者鑒定一個獨立于FoxO的基因d230025d16rik，命名為MYTHO（Macroautophagyand YouTH Optimizer）。在本研究中，作者經(jīng)過一系列功能實驗和分子研究推斷MYTHO是肌肉自噬和完整性的關鍵調(diào)節(jié)因子。本研究于2023年3月發(fā)表于《Nat Commun》，IF：17.694。

技術路線：

1、D230025D16Rik編碼的一種蛋白MYTHO，在不同的組織中表達并在分解代謝條件下轉(zhuǎn)錄上調(diào)

為鑒定新的FoxO依賴的調(diào)節(jié)自噬的基因，作者篩選已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組圖譜，尋找在饑餓野生型（WT）小鼠骨骼肌中上調(diào)但在FoxO1/3/4肌肉特異性敲除小鼠中功能不變的轉(zhuǎn)錄本。隨后，作者通過選擇在不同物種中保守的轉(zhuǎn)錄本和具有自噬相關的LIRs/GIMs基序（LC3相互作用區(qū)和GABARAP相互作用區(qū)）的開放閱讀框（ORF）來減少候選轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。從上述分析中，作者鑒定D230025D16Rik基因，根據(jù)其在C. elegans中對巨噬和壽命的調(diào)控能力，將其命名為Macroautophagy andYouTH Optimizer（MYTHO）。作者通過定量RT-qPCR證實MYTHO在WT小鼠的肌肉中被誘導，而在FoxO1/3/4SkmKO小鼠的肌肉中不被誘導（圖1A）。在小鼠組織中，MYTHO蛋白在肺和肝臟中大量表達，在心臟和各種肢體肌肉中表達較少（圖1B）。值得注意的是，MYTHO蛋白表達水平在富含快收縮糖酵解纖維的肌肉（脛骨前幾和腓腸?。┖透缓湛s氧化纖維的肌肉（比目魚?。┲邢嗨疲▓D1B）。幾個萎縮條件數(shù)據(jù)集獲得的上調(diào)基因（GSE63032、GSE20103、GSE48363和GSE145480），揭示肌肉MYTHO mRNA在多種分解代謝條件下上調(diào)（圖1C）。RT-qPCR證實這一點（圖1D），MYTHO mRNA在饑餓、失神經(jīng)、癌癥惡病質(zhì)和敗血癥等多種自噬條件所誘導。

為獲得MYTHO在分解代謝條件下的病理特征，作者在抑制改變肌肉質(zhì)量和自噬的不同模型中使用各種功能損失和增益方法。MYTHO敲低（MYTHO-KD）通過電穿孔sh-RNA的質(zhì)粒來實現(xiàn)，可以防止急性饑餓和腫瘤小鼠的TA萎縮（圖1E）。MYTHO-KD在很大程度上預防14天去神經(jīng)所引發(fā)的肌纖維萎縮（圖1E）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，腺病毒（AAV）介導的MYTHO-KD在3周內(nèi)顯著增加對照組小鼠的肌肉質(zhì)量，并減弱LPS誘導的肌肉萎縮（圖1F-H）。MYTHO-KD抑制LPS誘導的多種自噬蛋白和標記物含量的增加，包括p62/SOSMT1、BNIP3和LC3-I到LC3-Ⅱ的保護，暗示MYTHO很有可能調(diào)控自噬（圖1I-J）。這些數(shù)據(jù)表明，在萎縮條件下，MYTHO增加，抑制MYTHO可以抵消急性分解代謝條件下的萎縮。

圖1 D230025D16Rik編碼一種名為MYTHO的蛋白，該蛋白在不同組織中表達，并在分解代謝條件下轉(zhuǎn)錄上調(diào)

2、MYTHO是骨骼肌自噬所需的

為明確MYTHO是否在調(diào)控骨骼肌自噬中發(fā)揮重要作用，作者測量MYTHO蛋白在細胞內(nèi)的定位以及自噬體的標記（LC3B）和溶酶體（LAMP2）。作者在WT小鼠短屈?。‵DB）中電轉(zhuǎn)染編碼MYTHO-green fluorescent protein（MYTHO-GFP）和LC3BmCherry（LC3B-cherry）的質(zhì)粒，單個肌纖維進行可視化。在分離的骨骼肌肌纖維中，MYTHO-GFP與LC3B-cherry共定位（圖2A-B），但與LAMP2共定位程度較輕（圖2A-C），證實MYTHO與自噬相關。此外，當用營養(yǎng)剝奪來增加體內(nèi)的自噬通量時，MYTHO在自噬體和溶酶體上的定位增強（圖2A-C）。為評估當自噬體與溶酶體的融合被抑制時，MYTHO-GFP的定位是否被改變，在分離單個肌肉纖維之前，對動物注射秋水仙素（破壞微管網(wǎng)絡）。圖2B-C展示秋水仙素處理后，MYTHO-GFP和LC3B-mCheery的共定位增加，MYTHO-GFP和LAMP2-mcherry的共定位沒有改變。饑餓增加MYTHO-GFP和自噬體和溶酶體標志物的共定位；然而，秋水仙堿處理對MYTHO-GFP和LC3B-mCheery的共定位沒有影響，但顯著降低MYTHO-GFP在溶酶體的定位（圖2A-C）。這些結果說明MYTHO首先定位于自噬體，然后從自噬體轉(zhuǎn)移到溶酶體。

為進一步評估MYTHO對肌肉自噬的調(diào)節(jié)，作者研究秋水仙素處理后MYTHO-KD對自噬通量的影響。WT小鼠中含有sh-RNA寡核苷酸的MYTHO-KD在基礎條件下部分減少了自噬體的數(shù)量，并抑制饑餓引起的LC3B點狀細胞數(shù)量的增加（圖2D-E）。這些結果說明在分解代謝條件下，MYTHO是骨骼肌自噬增強的重要調(diào)控子。

圖2 MYTHO是骨骼肌自噬所必需的

3、延長骨骼肌中MYTHO消耗導致肌肉過度生長、損害肌肉收縮力，并誘導多種嚴重的肌病特征

為進一步探索MYTHO在控制骨骼肌質(zhì)量和功能中發(fā)揮的作用，作者測試MYTHO在不同時間點的影響。與之前的研究一致，AAV介導的MYTHO-KD在AAV介導后的第3周、第6周、12周和20周出現(xiàn)骨骼肌大量增加（圖3A）。為定義骨骼肌中MYTHO-KD的生理和功能影響，在AAV轉(zhuǎn)導后的第3、6、12和20周評估TA的收縮特性。AAV感染3周后，MYTHO-KD對肌肉沒有明顯的影響（圖3B）。然而，當AAV感染6、12和20周后，肌肉中的TA顯著低于MYTHO-KD組（圖3B）。上述數(shù)據(jù)表明長時間響應的MYTHO-KD反應增加的肌肉量在很大程度上是無用的。

為深入了解MYTHO-KD影響肌肉收縮能力的潛在機制，作者對肌肉切片進行組織學檢查。MYTHO-KD治療6周后發(fā)現(xiàn)一些組織異常，如不規(guī)則的藍色纖維、中心核纖維、炎癥細胞浸潤、肌纖維壞死核小直徑再生纖維（圖3C）。接下來，作者使用EBD染料評估肌纖維膜的完整性。6周的MYTHO-KD與EBD陽性纖維數(shù)量增加相關（圖3C-D）。另外，作者還對小鼠IgG陽性纖維的肌肉切片進行F4/80染色，作為細胞膜損傷的指標。6周MYTHO-KD和12周MYTHO-KD在一定程度上增加巨噬細胞浸潤（F4/80+區(qū)域），并誘導IgG陽性纖維的出現(xiàn)（圖3F）。這些數(shù)據(jù)表明延長MYTHO-KD導致嚴重的疾病特征出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)也突出表明MYTHO-KD引發(fā)的炎癥反應在AAV傳導后6周達到高峰。

為進一步研究MYTHO-KD對骨骼肌健康的影響，作者接下來對肌層粘連蛋白和細胞核進行免疫染色（DAPI染色），結果顯示，12周的MYTHO-KD導致纖維大小異常變化，肌纖維總數(shù)增加，TA中有中央細胞核的纖維數(shù)量增加（圖3H）。作者發(fā)現(xiàn)異常纖維大小變化在12周后，MYTHO-KD患者的纖維類型發(fā)生變化，其特征是IIB型纖維的比例增加8%，IIA型纖維的比例減少45%（圖3I）。這種由MYTHO-KD引發(fā)的纖維類型的轉(zhuǎn)變與編碼各種肌球蛋白重鏈（MHC）亞型的基因表達的改變和幾種再生肌生成標記的改變有關（圖3J-N）。事實上，Myog（編碼肌細胞生成素）和圍產(chǎn)期MHC異構體（Mhy8）的表達在MYTHO-KD后的不同時間點顯著增加，而Myh2（一個編碼IIA型MHC的基因）在AAV轉(zhuǎn)導后3、6、12和20周顯著下調(diào)。這些結果進一步證實MYTHO-KD延長導致多種肌病特征。

利用電子顯微鏡對肌肉樣本的觀察，進一步證實明顯的肌病特征是由延長MYTHO-KD反應引起的。正如圖4A所示，作者發(fā)現(xiàn)了明顯的超微結構異常，包括肌漿網(wǎng)擴張（SR）、板層體、線粒體腫脹、糖原積累、自噬物質(zhì)和管狀物質(zhì)大齡積累（圖4A）。接著，作者觀察到MYTHO-KD的肌肉中STMM1和SERCA2陽性纖維的數(shù)量增加（圖4B-C）。如圖4D，MYTHO耗盡減少Fam134b（一個重要的ER-phagy受體）的表達。類似于中央核疾病和和肌纖維疾病，作者觀察到有MYTHO-KD的肌肉中有desmin蛋白的積累（圖4E）。有趣的是MYTHO-KD肌肉的NADHTR染色揭示類似于中央核病變的核樣病變（圖4F）。為評估MYTHO-KD是否改變線粒體酶的表達，對肌肉切片的丁二酸脫氫酶（SDH）染色結果顯示，與未表達MYTHO-KD的肌肉相比，帶有MYTHO-KD的肌肉中SDH活性染色的整體強度明顯降低（圖4G-H）。此外，在帶有MYTHO-KD的肌肉中檢測到一些不規(guī)則的SDH陽性纖維（圖4G）。在saponin滲透的肌纖維中，線粒體Ca2+滯留能力的測量顯示出雙相變化，在MYTHO-KD六周后增加，12周后減少（圖4I）。這些表明骨骼肌的MYTHO耗竭導致嚴重的肌病，并伴有廣泛的超微結構病理改變，包括管狀聚集物和大量含有非晶態(tài)物質(zhì)的液泡的存在。

圖3 骨骼肌中長時間的MYTHO消耗導致過度生長，損害肌肉收縮力，并誘發(fā)幾種嚴重的肌病特征

圖4MYTHO耗竭導致超結構嚴重異常

4、MYTHO-KD觸發(fā)生長信號的激活和自噬受損

為探究MYTHO-KD誘導的肌肉腫大和肌病特征的機制，作者對MYTHO-KD后3周和12周獲得的GAS肌肉樣本進行微陣列分析。MYTHO-KD 12周后檢測到的前100個最穩(wěn)健的調(diào)控基因熱圖（圖5A）。長時間的MYTHO-KD改變了參與骨骼肌生長和發(fā)育的幾個基因的表達，如Igf2、Mustn1、Mybph和Lmcd1（圖5A）。GSEA顯示，161個基因上調(diào)，53個基因下調(diào)（Log2FC>2，p<0.05），在生長因子刺激的細胞反應、肌肉結構發(fā)育、創(chuàng)面愈合和細胞因子產(chǎn)生調(diào)控等方面均有顯著富集（圖5B，C）。RT-qPCR驗證了12周的MYTHO-KD增強Igf2、金屬硫蛋白Mt1和Mt2的表達，降低Mtsn的表達（圖5D）。

考慮到MYTHO-KD引發(fā)的進行性腫大，結合與生長信號相關的基因表達增加。作者下一步通過嘌呤霉素摻入分析來研究MYTHO-KD是否改變體內(nèi)肌肉蛋白的合成。12周的MYTHO-KD誘導肌肉蛋白合成的增加（圖5E）。作者還觀察到MYTHO-KD與AKT和S6（哺乳動物mTORC1的下游靶點）的磷酸化增加有關（圖5F）。這些結果表明，骨骼肌中MYTHO的缺失導致生長信號通路的持續(xù)激活。

為評估與MYTHO-KD相關的肌肉質(zhì)量增加是否部分通過抑制蛋白質(zhì)降解介導，作者通過測量自噬通量來評估自噬活動。作者發(fā)現(xiàn)12周的MYTHO-KD損傷了肌肉自噬，p62/SQSTM1和LC3BI的積累證明這一點，并降低LC3BⅡ/LC3BI比值（圖5G）。肌肉自噬在急性饑餓反應中的增加，在使用MYTHO-KD的肌肉中減弱（圖5G），這表明長期的MYTHO-KD會導致持續(xù)的自噬損傷。

圖5 MYTHO損耗激活生長信號

5、自噬對于MYTHO耗竭誘發(fā)肌病表型是可有可無的

考慮到MYTHO在體內(nèi)自噬過程中起著關鍵作用（圖2），作者接下來研究與MYTHO-KD相關的肌病特征是否由于抑制自噬體形成。為驗證其可能性，作者在肌肉特異性誘導Atg7敲除小鼠（Atg7iSkM-KO）的骨骼肌中引入MYTHO-KD（圖6A）。骨骼肌中Atg7缺失可阻止自噬體的形成（圖6C）。敲除MYTHO 12周后，Atg7iSkM-KO和WT小鼠的骨骼肌質(zhì)量增加到類似程度（圖6B），這表明MYTHO的作用不僅僅是自噬調(diào)節(jié)器。骨骼肌中MYTHO和Atg7的消耗導致LC3BI的顯著積累，與WT小鼠相比，Atg7iSkM-KO小鼠的MYTHO-KD肌肉中LC3BI的積累更為明顯（圖6C）。重要的是，MYTHO-KD導致WT和Atg7iSkM-KO小鼠肌肉中心的肌核比例相似，而單獨刪除Atg7對該參數(shù)無影響（圖6D-F）。雖然電子顯微鏡證實Atg7iSkM-KO小鼠肌肉中膜結構的積累，但這些超微結構異常明顯，且不像MYTHO-KD小鼠肌肉中觀察到的那么嚴重（圖6G）。這些結果表明，自噬的破壞是由MYTHO控制的系統(tǒng)之一，但不是唯一的系統(tǒng)，并參與肌病表型。

圖6 自噬對于MYTHO耗竭誘發(fā)肌病表型是可有可無的

6、雷帕霉素治療可改善MYTHO-KD誘導的肌病

由于MYTHO-KD導致mTORC1通路的慢性過度激活，作者推測使用雷帕霉素治療阻斷該通路可以預防或減弱由MYTHO-KD引發(fā)的肌病表型。為驗證猜想，作者制定了如圖7A所示的實驗方案。MYTHO-KD在載藥處理和雷帕霉素處理小鼠的骨骼肌中均成功（圖7B-C）。正如預期的那樣，MYTHO缺陷肌肉顯示S6Ser240/244的磷酸化增加，而用雷帕霉素治療的小鼠顯示S6Ser240/244的磷酸化減少（圖7D）。MYTHO-KD增加了肌肉質(zhì)量（增加18%），然而，在雷帕霉素治療的小鼠中，MYTHO-KD的這種影響被削弱（增加9%）（圖7E）。同樣，在注射了藥物的動物中，MYTHO-KD的破傷風等長TA比力峰值下降了約38%，而在注射了雷帕霉素的動物中，峰值下降為13%（圖7F）。雷帕霉素處理也減弱了具有中心核的纖維比例，但對MYTHO-KD組肌纖維的總體最小Feret直徑?jīng)]有重大影響（圖7G-I）。這些數(shù)據(jù)表明，雷帕霉素抑制mTORC1在一定程度上挽救MYTHO-KD對肌肉功能和完整性的惡性影響。

圖7 雷帕霉素治療改善MYTHO-KD誘導的肌病。

結論

本研究確定MYTHO是一個參與自噬、骨骼肌質(zhì)量和完整性調(diào)節(jié)的新基因。MYHTO敲低能夠抑制骨骼肌的基礎病理和饑餓誘導的自噬。在各種分解代謝的條件下，包括饑餓、癌癥惡病質(zhì)、失神經(jīng)和敗血癥，MYTHO的短期缺失可以保護肌肉萎縮，但其長期缺失導致嚴重的肌病表型，至少部分是由mTORC1通路的持續(xù)激活引起的（圖8）。MYTHO表達和功能的改變是否與人類肌肉疾病和其他人類疾病有關，還需要進一步的研究。

圖8 MYTHO：一種參與調(diào)節(jié)自噬、骨骼肌質(zhì)量和完整性的新基因。

參考文獻

Leduc-Gaudet JP, Franco-Romero A, Cefis M, Moamer A, Broering FE, Milan G, Sartori R, Chaffer TJ, Dulac M, Marcangeli V, Mayaki D, Huck L, Shams A, MoraisJA, Duchesne E, Lochmuller H, Sandri M, Hussain SNA, Gouspillou G. (2023) MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun;14(1):1199. doi: 10.1038/s41467-023-36817-1.