血管平滑肌細胞(VSMCs)的表型轉變是多種血管疾病早期的發病機制。代謝重編程可能參與VSMC表型轉變。然而，將能量代謝與不同VSMC表型聯系起來的確切分子仍然難以捉摸。我們利用基因本體注釋收集細胞能量調節基因，并對轉化生長因子-β或血小板衍生生長因子BB刺激的VSMCs進行RNA-Seq分析。prohibitin2缺乏的VSMCs失去了可收縮的表型，這可以通過減少可收縮蛋白來證明。與Phb2^flox/flox小鼠相比，Phb2^SMCKO小鼠更容易損傷后VSMC增殖和新內膜形成。進一步的蛋白質相互作用組分析、免疫共沉淀和哺乳動物2-雜交實驗顯示，prohibitin 2通過其C端直接與丙酮酸激酶M1/2 (PKM) mRNA拼接的關鍵調節因子hnRNPA1相互作用，促進PKM2表達和糖酵解。Prohibitin2缺失促進PKM1/2 mRNA剪接和PKM1向PKM2的逆轉，并增強VSMCs的糖酵解。阻斷2-hnRNPA1相互作用導致PKM2表達增加，糖酵解增強，VSMCs中收縮標記基因表達抑制，以及體內損傷后新內膜形成加劇。總之，Prohibitin 2通過與hnRNPA1相互作用來抵消hnRNPA1介導的PKM選擇性剪接和葡萄糖代謝重編程來維持VSMC的收縮表型。本文于2022年10月發表于Circulation Research (IF=23.213)。

技術路線：

結果：

(1) RNA序列分析預測新的將能量穩態與VSMCs收縮表型聯系起來的候選基因

為了識別連接細胞能量代謝和VSMC表型的新候選基因，我們首先進行了RNA-seq分析，以揭示轉化生長因子-β (TGF-β)處理增強收縮表型相關基因表達或血小板衍生生長因子BB (PDGF-BB)處理降低收縮表型相關基因表達的原發性大鼠VSMC的轉錄組變化。在這1893個基因中，有6個基因與細胞能量調節基因數據庫重疊，包括prohibitin 2 (PHB2)、瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員4 (TRPV4)、ALK酪氨酸激酶受體(ALK)、組蛋白賴氨酸n-甲基轉移酶PRDM16(PRDM16)、乙酰輔酶a羧化酶2 (ACACB)和載脂蛋白C-III (APOC3)(圖1A)。接下來，我們驗證了mRNA水平，發現原發性大鼠VSMCs中PHB2、TRPV4和ALK的表達確實受到TGF-β和PDGF-BB的相互調節(圖1B)。接下來，我們使用靶向Phb2、Trpv4和Alk的特異性小干擾RNA (siRNAs)檢測VSMC收縮標志物(ACT A2、CNN1和SM22α)的mRNA水平。如圖1C所示，沉默Phb2、Trpv4和Alk可導致VSMC收縮標志物的表達顯著降低，提示這3個基因可能是連接VSMC能量代謝與收縮表型的候選基因。在這3個基因中，有報道稱prohibitin 2與prohibitin 1共同調控線粒體中的細胞色素-c氧化酶組裝和線粒體呼吸。然而，prohibitin 2在VSMC身份和血管穩態中的確切作用仍然未知。另外的免疫熒光分析顯示，prohibitin2主要定位于人動脈介質層(圖1D)。因此，我們探討了prohibitin 2是否調控VSMC表型。

圖1：RNA序列分析預測了連接血管平滑肌細胞(VSMC)能量穩態和收縮表型的新候選基因

(2) Prohibitin2減少與VSMCs轉分化相關

進一步的Western blotting分析顯示，在原發大鼠VSMCs中，PDGF-BB刺激后，prohibitin 2蛋白水平與VSMCs收縮標記物同時降低(圖2A)。相反，TGF-β刺激的VSMCs表現出更高水平的prohibitin 2和收縮標志物(圖2B)。血清饑餓是觸發VSMC表型從去分化狀態向分化狀態轉變的典型刺激。血清饑餓VSMCs中prohibitin 2水平升高(圖2C)。RT-qPCR分析證實，在人類VSMCs中也觀察到類似的改變(補充圖未展示)。值得注意的是，在VSMCs表型轉化過程中，prohibitin-1蛋白水平無統計學差異(圖2A-2C)。同樣，與假手術動脈相比，球囊損傷后3、7和14天，大鼠頸動脈中prohibitin 2的表達顯著降低，同時VSMCs收縮標記物減少，內膜面積增加(圖2D)。因此，western blotting分析、RT-qPCR和免疫熒光分析表明，與對照組乳腺內動脈相比，頸動脈內膜切除術患者動脈中prohibitin2的表達明顯降低(圖2E-2G)。

圖2：Prohibitin 2減少與血管平滑肌細胞(VSMC)去分化相關

(3) Prohibitin 2在體外維持VSMCs的收縮表型

我們探討了prohibitin2表達的干擾是否會影響VSMC表型切換。siRNA介導的人VSMCsprohibitin 2沉默可導致收縮標記物水平降低(補充圖未展示)。因此，TGF-β促進VSMCs收縮蛋白表達的上調通過prohibitin 2沉默被取消(圖3A)。為了進一步確定prohibitin 2在體內VSMC表型中的確切作用，將Phb2^flox/flox小鼠與Tagln-Cre小鼠雜交，構建VSMC特異性Phb2缺失小鼠(Phb2^SMCKO小鼠)(補充圖未展示)。與Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，Phb2^SMCKO小鼠的原發性VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中的VSMCs收縮標記物的mRNA和蛋白質水平明顯降低(圖3B)。F-actin染色顯示，prohibitin 2沉默導致原發大鼠VSMCs從細長收縮形態轉變為多邊形合成形態(圖3C)。此外，經Phb2siRNA轉染的VSMCs與經siRNA打亂轉染的VSMCs相比，收縮能力降低，膠原凝膠收縮試驗證明了這一點(siRNA打亂與siRNAPhb2: 46.3±3.86% vs 71.2±4.35%，P<0.05)(圖3D)。從Phb2^SMCKO小鼠中分離出的主動脈環對苯腎上腺素的反應表現出收縮力減弱(圖3E)。在siRNAPhb2轉染的VSMCs中，細胞遷移活性也增加了，劃傷實驗和Boyden室實驗證明了這一點(圖3F和3G)。相反，prohibitin 2過表達2可挽救PDGF-BB誘導的VSMC收縮標記物減少和VSMC遷移(補充圖未展示)。綜上所述，這些數據表明禁用2是維持VSMCs收縮表型的關鍵。

圖3：Prohibitin 2在體外維持血管平滑肌細胞(VSMCs)的收縮表型

(4) VSMCs中Prohibitin 2的缺乏加劇體內損傷后新生內膜形成

對12周大的雄性Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠進行頸動脈鋼絲損傷。頸動脈MYH11 (VSMC標記物)和CD31 (EC標記物)免疫染色顯示，術后第0天，Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠的鋼絲損傷程度相同(補充圖未展示)。與Phb2^flox/flox動脈相比，鋼絲損傷后第3、5和7天，Phb2^SMCKO動脈中VSMC收縮標記物的表達減少，盡管新內膜形成沒有那么明顯的誘導(圖4A)。相反，損傷后14天，通過BrdU染色觀察到Phb2^SMCKO動脈細胞增殖活性增強(圖4B)。結果，Phb2^SMCKO小鼠的新內膜明顯大于Phb2^SMCKO小鼠(圖4C)。此外，Phb2^SMCKO動脈新內膜與中膜的比例遠高于Phb2^flox/flox動脈，而中膜面積和外彈性層周長在兩組間無統計學差異。此外，為了排除taglncre介導的Phb2敲除可能引起的胚胎發育影響，我們將Phb2floxflox小鼠與Myh11-CreERT2小鼠雜交(補充圖未展示)。然后，8周齡雄性Phb2^flox/flox小鼠和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠用他莫西芬誘導出生后VSMCs的抑制性2耗盡。兩組小鼠(Phb2^flox/flox+他莫西芬和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT+他莫西芬)頸動脈鋼絲損傷。與他莫昔芬處理的Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠相比，他莫昔芬處理的Phb2^flox/flox/flox小鼠線損傷誘導的新內膜形成顯著增加(圖4D)。因此，prohibitin 2在體內維持VSMCs的收縮表型。

圖4：體內血管平滑肌細胞(VSMCs)的Prohibitin 2缺乏加劇損傷后新內膜的形成

(5) HnRNPA1是一種新的Prohibitin2結合蛋白

我們使用原發大鼠VSMCs來探索連接prohibitin 2和VSMCs表型調制的潛在結合伙伴。3個蛋白條帶被抗prohibitin 2抗體特異性免疫沉淀，而不是對照IgG。14個被抗prohibitin 2抗體免疫沉淀而非對照IgG免疫沉淀的蛋白被鑒定為潛在的prohibitin 2結合伙伴，包括prohibitin1 (PHB1)、異質核核糖核蛋白A1 (hnRNPA1)、顆粒蛋白(GRN)、PRMT1蛋白染色質靶蛋白(CHTOP)、14-3-3蛋白zeta (YWHAZ)、srsf1、膜聯蛋白A2 (ANXA2)等(圖5A)。我們首先分析了prohibitin2缺乏是否會導致hnRNPA1表達的改變。在鋼絲損傷小鼠頸動脈中，hnRNPA1的表達減少。因此prohibitin 2對hnRNPA1的表達沒有調控作用。接下來我們評估了prohibitin 2和hnRNPA1的潛在相互作用。在原代大鼠VSMCs的細胞裂解液中，內源性prohibitin 2與抗hnRNPA1抗體共免疫沉淀，但不與對照IgG共免疫沉淀，反之亦然(圖5B)。進一步的共免疫沉淀分析顯示，prohibitin 2與抗hnRNPA1抗體共免疫沉淀，但與對照IgG未在原代大鼠VSMCs的核部分共免疫沉淀，但在細胞質部分不共免疫沉淀，這表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用發生在細胞核(圖5C)。hnRNPA1和prohibitin2一致地共定位于原發性大鼠VSMCs的細胞核(圖5D)。HEK293A細胞分別轉染hnRNPA1 FL/ΔM9/ΔRGGbox-M9質粒旁的pcDNA3.1-6×his-prohibitin 2質粒和flag-CMV質粒(圖5E)，然后使用抗flag抗體進行共免疫沉淀分析。hnRNPA1 FL和hnRNPA1ΔM9突變體均通過標志抗體特異性免疫沉淀出prohibitin 2，而不是對照IgG(圖5F)。hnRNPA1的RGG-box結構域與prohibitin 2結合(圖5G)。接下來，我們亞克隆了prohibitin 2的不同結構域(圖5H)。Flag-hnRNPA1通過抗flag抗體特異性免疫沉淀prohibitin 2的C端，但不通過對照IgG，反之亦然(圖5I)。通過哺乳動物2-雜交實驗驗證了prohibitin 2與hnRNPA1的C端相互作用(圖5J)。總之，通過其C端，prohibitin 2直接與hnRNPA1的RGG-box結構域相互作用。

圖5：異質核核糖核蛋白A1 (HnRNPA1)是一種新型的prohibitin 2結合蛋白

(6) HnRNPA1-Prohibitin 2相互作用對維持VSMC體內外收縮表型至關重要

我們研究核內prohibitin 2和hnRNPA1的相互作用是否對VSMC的收縮表型至關重要。將帶有C端M9結構域的hnRNPA1的RGG-box結構域亞克隆到腺病毒pAdT機架-CMV載體中，重組腺病毒(Ad-Flag-RGG-M9)用于阻斷hnRNPA1和prohibitin2的核相互作用。免疫共沉淀實驗顯示，Ad-Flag-RGG-M9感染顯著阻斷了原發大鼠VSMCs中prohibitin 2-hnRNPA1相互作用(圖6A)。Ad-FlagRGG-M9感染抑制了α-actin和SM22α的轉錄活性，從而導致VSMCs去分化和細胞遷移增加(圖6B-6E)。Ad-Flag-RGG-M9感染加劇了球囊損傷后第7天VSMC收縮標記物的減少和新內膜形成的誘導(圖6F)。Ad-Flag-RGG-M9感染加重了大鼠球囊損傷模型28天新生內膜的形成(圖6G)，而不會導致體重或血壓等顯著變化。免疫染色實驗證明，與假手術Ad-GFP感染大鼠頸動脈相比，球囊損傷Ad-GFP感染大鼠頸動脈VSMCs中prohibitin 2水平顯著降低(補充圖未展示)。在Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠頸動脈中，與Ad-GFP感染的大鼠頸動脈相比，prohibitin 2的水平沒有改變，這表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用不可能調控prohibitin 2的表達(補充圖未展示)。綜上所述，這些數據揭示了prohibitin 2-hnRNPA1相互作用對VSMC收縮表型維持的重要作用。

圖6：HnRNPA1-prohibitin 2相互作用對于維持血管平滑肌細胞(VSMCs)在體內外的收縮表型至關重要

(7) Prohibitin 2抑制hnRNPA1介導的pre-PKM mRNA剪接、PKM2表達和有氧糖酵解

hnRNPA1是pre-PKM mRNA剪接的主調控因子。PKM2是PKM的首選剪接異構體，調節糖酵解的最終限速步驟，而PKM1促進OXPHOS。這兩種異構體來自于PKM前mRNA的互排性選擇性剪接，反映了外顯子9 (PKM1)或外顯子10 (PKM2)的包含。hnRNPA1抑制外顯子9的序列側翼，導致外顯子10的包含和PKM2的表達。我們研究prohibitin 2是否影響hnRNPA1介導的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的產生和有氧糖酵解。與Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，從Phb2^SMCKO小鼠分離的原發性小鼠VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中PKM2的mRNA水平升高，而PKM1的mRNA水平下降(補充圖未展示)。相比之下，pre-PKM mRNA水平沒有顯著改變，表明存在另一種剪接。PstI和NcoI酶切擴增子后進一步RTPCR顯示Phb2缺失促進PKM1向PKM2的反式表達(圖7A)。在Phb2 KO原發小鼠VSMCs(圖7B)、Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠VSMCs(圖7C)以及感染Ad-Flag-RGG-M9的球囊損傷大鼠頸動脈中使用western blotting也觀察到了類似的結果。Phb2 KO VSMCs糖酵解活性增強，OXPHOS活性降低，細胞糖酵解和有絲分裂應激試驗證明(圖7D)。PDGF-BB刺激的原發大鼠VSMCs中prohibitin 2被抑制的轉分化通過PKM2過表達被取消(圖7E)。為了進一步闡明prohibitin2是否在體內通過抑制PKM2的表達來維持VSMC的收縮表型和對抗新生內膜的形成，我們使用帶有SM22α啟動子的AAV9載體選擇性下調VSMC中的PKM2。在Phb2^SMCKO小鼠頸動脈鋼絲損傷后第7天，VSMC特異性PKM2耗損挽救了VSMC收縮標記物的減少(補充圖未展示)。Phb2^SMCKO小鼠鋼絲損傷后血管收縮力下降和新生內膜形成增強均因VSMC特異性PKM2耗損而得到挽救(圖7F-7G)。綜上所述，prohibitin2與核hnRNPA1直接相互作用，抑制hnRNPA1介導的pre-PKM mRNA剪接和PKM2的產生，從而調節葡萄糖代謝重編程，在體外和體內維持VSMCs的收縮表型。

圖7：Prohibitin2抑制hnRNPA1介導的pre-PKM mRNA剪接、丙酮酸激酶異構體M2 (PKM2)表達和葡萄糖代謝重編程

結論：

Prohibitin2通過直接與核hnRNPA1相互作用，抑制hnRNPA1介導的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的產生，從而調節葡萄糖代謝重編程(圖8)，維持VSMCs的收縮表型，抑制損傷后新內膜的形成。Prohibitin2是維持VSMCs穩態的內源性糖酵解調節劑。以prohibitin2-hnRNPA1-PKM2軸為靶點調節VSMC能量代謝可能有助于心血管疾病的治療。

圖8：Prohibitin2在血管平滑肌細胞(VSMC)表型測定的示意圖

參考文獻：

Jia, Y., Mao, C., Ma, Z., Huang, J., Li, W., Ma, X., Zhang, S., Li, M., Yu, F., Sun, Y., Chen, J., Feng, J., Zhou, Y., Xu, Q., Zhao, L., Fu, Y., & Kong, W. (2022). PHB2 Maintains the Contractile Phenotype of VSMCs by Counteracting PKM2 Splicing. Circulation research, 131(10), 807–824. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.122.321005.