結直腸癌(CRC)是全球癌癥死亡的主要原因。腫瘤抑制基因或原癌基因啟動子中DNA甲基化的異常調控是CRC發生和發展的基本過程之一。鋅指蛋白(ZNFs)是最豐富的蛋白質群之一,在與腫瘤發生相關的許多重要生物學過程中起作用。我們在CRC組織中檢測到與正常組織相比,ZNF334基因的異常高甲基化,這種修飾下調了ZNF334的表達。此外,TET1被鑒定參與調節ZNF334的甲基化水平。體外和體內實驗均表明,靶向去甲基化系統上調了ZNF334的表達,抑制了CRC的生長。總之,ZNF334啟動子的靶向DNA去甲基化揭示了CRC的精確治療。本文于2023年3月發表于“Cell Death and Disease”(IF=9.685)上。
技術路線
結果
1)CRC中ZNF334下調受DNA甲基化調控
為了研究CRC中ZNF334的特征,基于TCGA數據庫進行了在線分析。首先,我們利用TCGA項目中收集的泛癌視圖分析數據集,比較了ZNF334在24個腫瘤組織和正常組織中的表達。結果顯示,與正常組織相比,大多數腫瘤組織中ZNF334表達降低,CRC組織中ZNF334表達下調存在顯著性差異(圖1A)。我們進一步根據癌癥分期分析了ZNF334在CRC中的表達情況。結果顯示,與正常組織相比,ZNF334在1期CRC中表達明顯下調,而在2、3、4期CRC中無明顯差異(圖1B)。同時,ZNF334基因啟動子在人CRC組織中的甲基化程度明顯高于遠端組織(圖1C)。為了進一步研究ZNF334在CRC中的表達水平和啟動子甲基化狀態,我們收集了93個包含臨床分期和預后的CRC組織,其中49個包含配對的相鄰正常組織。利用我院采集的組織進行qRT-PCR檢測ZNF334,結果顯示97.96%的人結直腸癌組織中ZNF334較鄰近正常組織下調(圖1D)。惡性組織中甲基化率較高(圖1E)。事實上,ZNF334中CpG甲基化的平均百分比與其表達水平呈負相關(圖1F),表明DNA甲基化抑制了人類結直腸腫瘤中ZNF334的轉錄。接下來,根據中位數將ZNF334的表達和甲基化程度分為“高”和“低”。結果顯示,ZNF334 mRNA的表達是CRC患者預后的積極指標(圖1G),同時,ZNF334甲基化在CRC患者中具有預測作用(圖1H)。此外,還檢測了HCoEpiC和CRC細胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)中ZNF334在mRNA水平上的表達。我們觀察到CRC細胞中ZNF334 mRNA的表達水平低于HCoEpiC(圖1I)。根據BSP測序,CRC細胞中有29個CpG位點高甲基化(圖1J)。這些結果表明,ZNF334在人結直腸腫瘤組織中的下調是DNA甲基化依賴的,ZNF334的表達和甲基化可能是CRC患者預后的潛在指標。
2)CRC中DAC和AZA誘導的去甲基化作用介導了ZNF334的上調
為了進一步確定DNA甲基化在ZNF334下調中的潛在作用,我們使用兩種廣譜去甲基化劑AZA和DAC處理CRC細胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)。采用CCK-8法檢測CRC細胞的增殖能力。結果顯示AZA和DAC處理的CRC細胞增殖活性降低,且增殖活性與AZA和DAC濃度呈負相關(圖2A, B),同時我們觀察到AZA和DAC處理后的ZNF334 mRNA表達水平高于未處理的細胞(圖2C, D)。我們進一步探索了AZA和DAC是否會影響體外CRC細胞凋亡。結果顯示AZA和DAC處理的HCT116細胞的凋亡率明顯高于對照組(圖2E)。BSP產物測序也顯示AZA和DAC處理的CRC細胞中ZNF334基因啟動子區域的甲基化降低(圖2F)。綜上所述,在CRC細胞中,DNA甲基化抑制了ZNF334的表達。
3)TET1刺激ZNF334的活性去甲基化
為了進一步研究甲基化在CRC細胞中ZNF334失活中的作用,我們通過qRT-PCR檢測了HCoEpiC和CRC細胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)中TET (TET1、TET2和TET3)的表達。結果顯示,TET1 mRNA在CRC細胞中的表達水平低于HcoEpiC細胞(圖3A)。qRT-PCR結果顯示,與鄰近正常組織相比,54.02%的人結直腸腫瘤組織中的TET1水平下調(圖3B)。隨后選擇HCT116和RKO細胞進行進一步分析,因為這兩種細胞中TET1表達較低。pLVX-MYRF-TET1感染HCT116和RKO細胞。qRT-PCR分析顯示,TET1在HCT116和RKO細胞中的mRNA表達水平明顯高于空白對照組(圖3C)。此外,TET1組顯著抑制了HCT116和RKO細胞的增殖(圖3D)。最后,qRT-PCR結果顯示,在CRC細胞中過表達TET1后,ZNF334的表達水平有效上調(圖3E)。綜上所述,TET1介導的DNA甲基化參與了ZNF334在CRC細胞中的表達調控。
4)體外ZNF334靶向去甲基化的抗腫瘤作用
為了通過特異性去甲基化逆轉ZNF334的表達,我們設計了5個sgRNAs,構建了基于dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CDsgRNA的特異性去甲基化體系。通過將TET1的催化結構域融合到用熒光報告GFP標記的失活Cas9的N端來生成該體系(圖4A)。轉染dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334后,在HCT116細胞中瞬時轉染效率達到86.48%(圖4B)。qRT-PCR結果證實,在HCT116細胞中,ZNF334在mRNA水平上有效上調(圖4C)。基于BSP產物的測序也顯示,轉染dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334的CRC細胞中CpG甲基化降低(圖4D)。隨后,使用CCK-8方法測量HCT116細胞的增殖率。實驗結果顯示,dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334顯著抑制了HCT116細胞的增殖(圖4E)。此外,dCas9multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334轉染組的HCT116細胞遷移量低于對照組(圖4F)。這些結果證明了ZNF334靶向去甲基化在CRC中的抗腫瘤作用。此外,通過任何基于cas9的技術在感興趣的基因組中識別脫靶切割是重要的。因此,我們使用COSMID在線工具選擇了前5個潛在的脫靶位點,以檢測它們的mRNA轉錄水平是否因脫靶去甲基化而改變(圖4G)。如圖4H所示,dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334組與dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA及空白對照組之間,這些潛在脫靶基因的mRNA表達量均無明顯差異(圖4H)。這些結果表明dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334對ZNF334的去甲基化是有效和特異性的。
接下來,為了評估ZNF334靶向去甲基化對體內腫瘤生長的作用,將dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334或dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA轉染的5 × 106個HCT116細胞注射到雌性野生型(WT) BALB/c裸小鼠腹部,建立皮下腫瘤模型(圖5A)。我們的結果表明,ZNF334的靶向去甲基化顯著降低了HCT116細胞的腫瘤體積(圖5B)。靶向去甲基化ZNF334也顯著抑制了HCT116細胞的重量(圖5C),此外,靶向去甲基化ZNF334后,HCT116腫瘤中凋亡細胞增多,增殖細胞減少(圖5D, E)。我們還通過內皮特異性抗原CD31染色,確定了ZNF334的靶向去甲基化對腫瘤血管化的影響。如圖5E所示,用ZNF334的靶向去甲基化治療可顯著降低CD31染色(圖5F)。總的來說,這些數據表明,ZNF334的靶向去甲基化是治療CRC的一種潛在的抗腫瘤策略。
結論:
我們的研究表明,啟動子區高DNA甲基化水平可下調ZNF334的表達,并參與CRC的發生。接下來,我們使用dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334特異性下調ZNF334啟動子區域的甲基化水平,這可以恢復ZNF334的表達,并在體外和體內均具有顯著的抗腫瘤作用。綜上所述,我們探索了抑癌基因ZNF334在結直腸癌發生中的生物學作用,為結直腸癌的早期診斷和精準治療提供了新的靶點和臨床依據。
參考文獻:
Yang B, Tang H, Wang N, Gu J, Wang Q. Targeted DNA demethylation of the ZNF334 promoter inhibits colorectal cancer growth. Cell Death Dis. 2023 Mar 25;14(3):210. doi: 10.1038/s41419-023-05743-x.