m5C修飾主要由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2誘導(dǎo)，是mRNA中重要的轉(zhuǎn)錄后化學(xué)修飾，已被證明在許多癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，NSUN2介導(dǎo)的m5C在骨肉瘤(OS)中的作用和潛在的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSUN2在骨肉瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)NSUN2表達(dá)越高，OS患者預(yù)后越差。我們的研究表明NSUN2可以促進(jìn)OS細(xì)胞的進(jìn)展。通過RNA測序、RIP、甲基化RIP篩選驗(yàn)證NSUN2的候選靶點(diǎn)，確定FABP5為靶點(diǎn)。我們觀察到NSUN2通過誘導(dǎo)m5C修飾穩(wěn)定FABP5 mRNA，并進(jìn)一步促進(jìn)OS細(xì)胞的脂肪酸代謝。此外，下調(diào)FABP5表達(dá)和添加脂肪酸氧化抑制劑均能抵消NSUN2對(duì)OS進(jìn)展的促進(jìn)作用。我們的研究證實(shí)NSUN2可以通過m5C提高FABP5 mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)FABP5的表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的脂肪酸代謝，最終起到促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的作用。我們的研究結(jié)果表明，NSUN2是骨肉瘤患者有希望的預(yù)后標(biāo)志物，并可能作為骨肉瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2023年2月發(fā)表于Cell Death and Disease（IF=9.685）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）NSUN2在骨肉瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)

為了評(píng)估NSUN2在人類OS中的表達(dá)譜，我們分析了GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NSUN2在OS組織中高表達(dá)(圖1A,1B)。然后，我們分析來自UCSCXENA的TARGET-OS中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的生存信息，發(fā)現(xiàn)NSUN2表達(dá)越高，OS患者預(yù)后越差(圖1C)。此外，我們采用逆轉(zhuǎn)錄qPCR (RT-qPCR)、免疫組化(IHC)和免疫印跡(western blot)方法檢測了正常和骨肉瘤腫瘤組織中NSUN2的表達(dá)。RT-qPCR(圖1D)、IHC(圖1E)和western blot(圖1F)結(jié)果顯示NSUN2在OS組織中表達(dá)較高。根據(jù)NSUN2 IHC評(píng)分，23個(gè)腫瘤組織被鑒定為“高”(47.92%)，22個(gè)腫瘤組織被鑒定為“中”(45.83%)，3個(gè)腫瘤組織被鑒定為“低”(6.25%)；5個(gè)正常組織鑒定為“高”(10.41%)，11個(gè)正常組織鑒定為“中”(22.92%)，32個(gè)正常組織鑒定為“低”(66.67%)。這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖如圖1E所示。此外，NSUN2在骨肉瘤細(xì)胞系(143b, MG63, U2)中的表達(dá)也高于骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和人成骨細(xì)胞(hbb1.19)(圖1G, H)。綜上所述，所有這些結(jié)果提示NSUN2在OS中上調(diào)，且NSUN2高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。

2）NSUN2缺乏顯著抑制體外骨肉瘤的進(jìn)展

為了闡明NSUN2在OS進(jìn)展中的功能作用，我們選擇143b和U2細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步研究。我們使用shNSUN2#1和sh-NSUN2#2生成穩(wěn)定的NSUN2敲除OS細(xì)胞系，然后檢測這些細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。RT-qPCR和western blot結(jié)果顯示，sh-NSUN2#1和sh-NSUN2#2顯著降低了143b細(xì)胞(圖2A、B)和U2細(xì)胞(圖2C、D)中NSUN2的表達(dá)。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，NSUN2缺乏降低了143b細(xì)胞和U2細(xì)胞的增殖能力(圖2E-G)。為了檢測骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，我們進(jìn)行了傷口愈合和transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)敲除NSUN2后，143b和U2細(xì)胞的侵襲能力(圖2H)和遷移能力(圖2I)下降。總的來說，這些結(jié)果表明，在體外敲除NSUN2表達(dá)對(duì)骨肉瘤的進(jìn)展有負(fù)面影響。

3）NSUN2缺乏可抑制OS細(xì)胞在體內(nèi)的增殖

我們用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-NSUN2#1或sh-ctrl的143b細(xì)胞和U2細(xì)胞在裸鼠中生成腫瘤異種移植。我們將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的OS細(xì)胞接種于裸鼠左脛骨上段，觀察腫瘤大小3周。接下來，我們犧牲所有裸鼠，并收集左腿進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)。此外，我們收集并稱重所有腫瘤。正如預(yù)期的那樣，sh-NSUN2#1組腫瘤的最終大小小于sh-ctrl組(圖3A-D)。此外，微CT掃描的結(jié)果顯示sh-NSUN2#1組左腿骨破壞較輕，腫瘤體積較小(圖3E, G)。此外，sh-NSUN2#1組腫瘤重量較輕(圖3F、H)。IHC結(jié)果證實(shí)NUSN2和Ki- 67的表達(dá)在sh-NSUN2 # 1組腫瘤中降低(圖31)。上述結(jié)果表明，NSUN2缺乏抑制OS細(xì)胞體內(nèi)的增殖。

4）FABP5是NSUN2的潛在靶點(diǎn)

為了確定OS細(xì)胞中NSUN2的下游靶點(diǎn)，我們對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNSUN2#1或OE-NSUN2的143b細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq。我們重點(diǎn)研究了與NSUN2表達(dá)水平呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的基因(圖4A)，并制作了包含所有這些基因的兩張熱圖(圖4B)。從熱圖中，我們得出結(jié)論，FABP5在“shNSUN2 VS sh-ctrl”和“OE-NSUN2 VS OE ctrl”中表達(dá)變化最顯著。因此，我們推測FABP5是NSUN2在骨肉瘤細(xì)胞中的潛在靶點(diǎn)，且NSUN2通過調(diào)控FABP5的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的143b和U2細(xì)胞中，用RT-qPCR檢測了FABP5 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)敲低NSUN2時(shí)，FABP5 mRNA的表達(dá)水平明顯下降(圖4C, F)，過表達(dá)NSUN2時(shí)，FABP5 mRNA的表達(dá)水平升高(圖4D, G)。western blot結(jié)果也證實(shí)，敲低NSUN2時(shí)FABP5蛋白表達(dá)水平下降，過表達(dá)NSUN2時(shí)FABP5蛋白表達(dá)水平升高(圖4E, H)。為了確定NSUN2是否通過直接或間接作用影響FABP5的表達(dá)，我們采用RIP法檢測NSUN2蛋白是否能與FABP5 mRNA結(jié)合。結(jié)果顯示，我們從143b和U2細(xì)胞中分離出的RNA中含有FABP5 mRNA(圖4I, J)，說明NSUN2蛋白可以直接與FABP5 mRNA結(jié)合。以上結(jié)果表明，NSUN2蛋白可以直接靶向FABP5 mRNA，影響FABP5的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的猜想，我們用RT-qPCR檢測了我們采集的骨肉瘤組織和正常組織中FABP5 mRNA的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)FABP5在骨肉瘤組織中也是高表達(dá)的(圖4K)。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了我們的猜想，FABP5是NSUN2在骨肉瘤細(xì)胞中的潛在靶點(diǎn)。

5）NSUN2通過m5C促進(jìn)FABP5 mRNA的穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NSUN2是否通過m5C調(diào)控FABP5的表達(dá)，我們構(gòu)建了一個(gè)具有突變位點(diǎn)的NSUN2過表達(dá)質(zhì)粒。前期研究證明NSUN2主要依靠C271和C321位點(diǎn)的兩個(gè)半胱氨酸發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。C321位點(diǎn)的半胱氨酸與胞嘧啶嘧啶環(huán)形成共價(jià)鍵，催化胞嘧啶甲基化，而C271位點(diǎn)的半胱氨酸介導(dǎo)甲基化RNA的釋放。因此，我們在NSUN2的C271位點(diǎn)將“TG”突變?yōu)?/span>“GC”，使原序列“TGC”突變?yōu)?/span>“GCC”。通過這種方法，我們在NSUN2的C271位點(diǎn)將半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷２捎猛瑯拥姆椒ǎ覀冞€在NSUN2的C321位點(diǎn)將半胱氨酸突變?yōu)楸彼?/span>(圖5A)，然后將突變的NSUN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到143b和U2細(xì)胞中，用點(diǎn)印跡法檢測所有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的m5C水平。我們發(fā)現(xiàn)sh-NSUN2導(dǎo)致m5C水平降低，而過表達(dá)NSUN2導(dǎo)致m5C水平升高(圖5B)。然而，轉(zhuǎn)移到突變NSUN2質(zhì)粒的細(xì)胞m5C水平?jīng)]有任何變化(圖5B)。為了確認(rèn)NSUN2是否可以調(diào)節(jié)FABP5 mRNA的m5C水平，我們對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的143b和U2細(xì)胞進(jìn)行了甲基化RIP實(shí)驗(yàn)。m5C甲基化-RIP的結(jié)果顯示，過表達(dá)NSUN2可以促進(jìn)143b和U2細(xì)胞FABP5 mRNA的m5C水平，而突變NSUN2則不能。環(huán)亮氨酸可降低143b和U2細(xì)胞FABP5 mRNA的m5C水平，并呈濃度依賴性(圖5C, D)。然后，我們用RT-qPCR檢測143b和U2細(xì)胞中NSUN2和FABP5的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)MUT-NSUN2可以促進(jìn)NSUN2的表達(dá)，但不能促進(jìn)FABP5的表達(dá)。環(huán)亮氨酸可以降低FABP5的表達(dá)，而不降低NSUN2的表達(dá)(圖5E, F)。綜上所述，m5C水平越高，FABP5 mRNA的表達(dá)也越高。接下來，我們研究NSUN2介導(dǎo)的m5C如何調(diào)控FABP5 mRNA的表達(dá)。我們檢測放線菌素D (ActD, 5μg/ml)處理的143b和U2細(xì)胞中FABP5 mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，FABP5 mRNA的m5C水平越高，衰減到50%所需的時(shí)間越長，穩(wěn)定性越好。也就是說，NSUN2可以通過m5C促進(jìn)OS細(xì)胞中FABP5 mRNA的穩(wěn)定性。此外，我們通過western blot檢測143b和U2細(xì)胞中FABP5蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FABP5 mRNA的m5C水平越高，FABP5蛋白的表達(dá)越高(圖5I, J)。

6）NSUN2促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞脂肪酸代謝

眾所周知，FABP5在脂肪酸代謝中起著非常重要的作用。為了評(píng)估NSUN2是否能促進(jìn)OS細(xì)胞的脂肪酸代謝，我們首先用BODIPY 493/503檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的143b和U2細(xì)胞的中性脂質(zhì)水平。結(jié)果表明，NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞中性脂質(zhì)的收縮。與NSUN2類似，FABP5過表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致中性脂質(zhì)減少，敲除可增加骨肉瘤細(xì)胞中中性脂質(zhì)的積累。此外，MUT-NSUN2未能改變OS細(xì)胞中中性脂質(zhì)的含量，而依托莫司則增加了OS細(xì)胞中中性脂質(zhì)的含量。與NSUN2過表達(dá)相比，環(huán)亮氨酸可通過降低FABP5 mRNA的m5C水平來降低FABP5的表達(dá)，從而影響OS細(xì)胞中中性脂質(zhì)含量(圖6A-D)。此外，我們還檢測了游離脂肪酸(FFAs)和甘油的含量，以評(píng)估OS細(xì)胞的脂解活性。結(jié)果表明，OE-NSUN2和OE-FABP5均能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中FFAs和甘油的水平。正如預(yù)期的那樣，MUT-NSUN2未能改變OS細(xì)胞中FFAs和甘油的含量，而依托莫司則降低了OS細(xì)胞中FFAs和甘油的含量(圖6E-H)。綜上所述，NSUN2通過上調(diào)FABP5在OS細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)中性脂質(zhì)的脂解。

7）脂肪酸氧化抑制劑和FABP5缺乏均可抵消NSUN2對(duì)OS進(jìn)展的積極作用

為了進(jìn)一步證實(shí)NSUN2是否通過促進(jìn)FABP5的表達(dá)和脂肪酸代謝促進(jìn)OS的進(jìn)展，我們對(duì)143b細(xì)胞進(jìn)行了功能挽救實(shí)驗(yàn)。我們首先檢測了FABP5 mRNA(圖7A)和蛋白質(zhì)(圖7B)的表達(dá)水平。CCK-8的結(jié)果表明(圖7C)和菌落形成實(shí)驗(yàn)(圖7D,G)， NSUN2過表達(dá)對(duì)143b細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用可被依托莫司或FABP5缺失所抵消。FABP5過表達(dá)對(duì)143b細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用與NSUN2過表達(dá)相似。此外，依莫莫司可降低143b細(xì)胞的增殖。在transwell和傷口愈合試驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果。NSUN2過表達(dá)對(duì)143b細(xì)胞的遷移和侵襲有積極影響，但這種積極影響被FABP5缺失或依托莫司抵消。FABP5過表達(dá)對(duì)143b細(xì)胞的遷移和侵襲也有積極影響，而依托莫司則有負(fù)面影響(圖7E, F, H, I)。此外，我們利用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證了NSUN2-FABP5軸在OS進(jìn)展中的功能作用。IHC結(jié)果(圖7I, J)證明過表達(dá)NSUN2可以提高Ki-67的表達(dá)，而sh-FABP5可以抵消這種促進(jìn)作用。綜上所述，證明NSUN2通過促進(jìn)FABP5的表達(dá)和脂肪酸代謝來促進(jìn)OS的進(jìn)展，而這種促進(jìn)作用可以通過FABP5缺失或脂肪酸氧化抑制劑依托莫司來抵消。

結(jié)論：

NSUN2通過m5C提高FABP5 mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)FABP5的表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的脂肪酸代謝，最終起到促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的作用。

參考文獻(xiàn)：

Yang M, Wei R, Zhang S, Hu S, Liang X, Yang Z, Zhang C, Zhang Y, Cai L, Xie Y. NSUN2 promotes osteosarcoma progression by enhancing the stability of FABP5 mRNA via m5C methylation. Cell Death Dis. 2023 Feb 15;14(2):125. doi: 10.1038/s41419-023-05646-x.