胃癌是全球最常見的人類惡性腫瘤之一，每年有超過95萬的新發(fā)病例被診斷出來，尤其在東亞和東歐。盡管在過去的幾十年里，胃癌的放化療和手術取得了一些進展，但仍有40%的胃癌患者發(fā)生轉移，其中只有5%的患者生存超過5年。因此，需要進一步研究胃癌轉移的分子機制，以開發(fā)新的治療策略。越來越多的證據表明，lncRNA在各種類型癌癥的增殖、凋亡、侵襲、轉移、血管生成和耐藥方面發(fā)揮核心作用。通過使用lncRNA芯片比較腫瘤和匹配的癌旁組織，作者之前證明了一些lncRNA在胃癌中異常表達。其中，lncRNA BC002811在胃癌組織中高表達。但BC002811在胃癌中的作用及機制有待進一步研究。該研究發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》，IF：10.75。

研究路線：

主要研究結果：

1. BC002811在胃癌中表達上調并與較差的生存率顯著相關

在之前的研究中，作者使用lncRNA芯片比較了胃癌樣本和匹配的鄰近非腫瘤樣本，發(fā)現BC002811在胃癌中表達上調。為了證實這一增加，作者利用組織微陣列，通過原位雜交在163對臨床胃癌樣本和鄰近非腫瘤胃組織中評估了BC002811的表達水平。BC002811染色強度分為陰性、弱、中或強（圖1A）。胃癌組織中的BC002811 ISH評分高于癌旁組織（圖1B）。此外，研究發(fā)現BC002811高水平與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移相關。為了驗證作者的發(fā)現，作者通過qPCR檢測了BC002811在31個配對的手術切除的人胃癌/癌旁組織以及4個胃癌細胞系和正常胃黏膜上皮細胞系GES-1中的表達。BC002811在胃癌組織中的表達始終高于相應的癌旁組織（圖1C）。作者還發(fā)現，與GES-1細胞相比，BC002811在AGS、Hs746T、HGC-27和NCI-N87細胞中表達增加（圖1D）。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析BC002811表達水平對胃癌患者總生存期（overall survival，OS）的影響，探討BC002811表達水平與胃癌患者臨床預后的關系。BC002811高表達胃癌患者的中位OS為15個月，明顯短于低表達胃癌患者（圖1E）。

圖1lncRNA BC002811在胃癌組織中表達升高

2. BC002811在體外對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲具有顯著影響

通過轉染BC002811過表達載體和靶向BC002811的小干擾RNA，研究BC002811對胃癌細胞關鍵生物學特性的影響。MTS實驗顯示，敲低BC002811后，AGS和HGC-27細胞的增殖能力減弱（圖2A）。與細胞增殖下降相一致，沉默BC002811的AGS和HGC-27細胞的克隆形成效率也明顯低于對照組細胞（圖2B）。相比之下，外源性表達BC002811可增加AGS和HGC-27細胞的增殖和集落形成（圖2A-B）。流式細胞術顯示，下調BC002811表達可誘導AGS和HGC-27細胞凋亡，而上調BC002811表達可降低細胞凋亡（圖2C）。Transwell實驗檢測BC002811對細胞侵襲和遷移的影響。過表達BC002811導致遷移和侵襲細胞數量明顯增加，而敲低BC002811則產生相反的結果（圖2D）。BC002811的表達與胃癌細胞體外增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關。

圖2BC002811促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制胃癌細胞凋亡

3. BC002811促進胃癌細胞體內成瘤和轉移

裸鼠體內注射穩(wěn)定敲低BC002811的HGC-27細胞、穩(wěn)定過表達BC002811的AGS細胞和相應的對照細胞，觀察BC002811對胃癌細胞體內成瘤和轉移的影響。如圖3A-C，與注射對照細胞的小鼠相比，注射穩(wěn)定敲低BC002811細胞的小鼠顯示出明顯的腫瘤異種移植生長抑制。sh-BC002811組的腫瘤重量也明顯低于對照組（圖3D）。相反，BC002811的穩(wěn)定過表達增加了腫瘤生長（圖3A-D）。同樣，體內尾靜脈轉移實驗結果顯示，BC002811穩(wěn)定敲低組動物的肺轉移較少，而BC002811穩(wěn)定過表達組則相反，肺組織切片HE染色證實了這一點（圖3E-H）。這些數據表明，BC002811增加了致癌活性，并在體內具有促進轉移的作用。

圖3BC002811在體內調節(jié)腫瘤生長和轉移

4. MMP2、MMP9和PTEN是BC002811參與胃癌轉移的關鍵下游靶點

為了進一步研究可能參與BC002811促進胃癌轉移的基因，作者使用了人類腫瘤轉移qPCR芯片。如圖4A，在涉及人類腫瘤轉移的84個關鍵基因中，BC002811調控了3個差異表達基因（MMP2, MMP9和PTEN）。MMP2和MMP9是眾所周知的腫瘤轉移標志物，而PTEN是一個特征明確的腫瘤抑制基因，在胃癌的轉移中起主要作用。qPCR顯示，在AGS和HGC-27細胞中過表達BC002811導致PTEN mRNA表達顯著降低，MMP2和MMP9 mRNA表達顯著升高，而敲低BC002811則產生相反的效果（圖4B）。蛋白質印跡（圖4C）和免疫組織化學檢測（圖4D）進一步證實了BC002811對這些基因的調控。這些結果證實了作者之前的發(fā)現，BC002811促進胃癌轉移。

圖4PTEN、MMP2和MMP9是BC002811的下游靶點

5. BC002811部分通過調控PTEN的表達來調控胃癌細胞的遷移和侵襲

為了探究PTEN是否參與BC002811的促進轉移功能，在胃癌細胞株AGS和HGC-27中過表達PTEN。Transwell實驗顯示，上調PTEN抑制了AGS和HGC-27細胞的侵襲和遷移，而過表達BC002811逆轉了這一作用（圖5A）。與此一致，過表達BC002811還消除了PTEN介導的對MMP2/MMP9表達的抑制，以及MMP2/MMP9的酶活性（圖5B-E）。由于PTEN被認為在胃癌轉移的調節(jié)中具有關鍵功能，作者的研究結果表明，BC002811至少部分通過PTEN來調節(jié)胃癌的轉移。

                      圖5BC002811部分通過調控PTEN促進胃癌細胞的遷移和侵襲

6. BC002811通過與SOX2相互作用抑制PTEN的表達

最近的研究報道，lncRNA通過與蛋白的相互作用，通過對癌基因或腫瘤抑制基因的轉錄和表觀遺傳調控影響胃癌轉移。為了探索BC002811是否通過這種方式影響胃癌細胞的轉移，作者試圖通過RNA pull-down實驗鑒定胃癌細胞中與BC002811相關的蛋白。經SDS-PAGE和銀染后，對BC002811 pull-down特異性蛋白條帶進行質譜分析（圖6A）。質譜分析鑒定出的主要蛋白為轉錄因子SOX2（圖6B），這也被蛋白質印跡法證實（圖6C）。為了進一步證實BC002811與SOX2之間的相互作用，作者使用SOX2抗體進行了RNA免疫沉淀。作者觀察到相對于IgG對照抗體，BC002811在SOX2抗體RIP中富集(圖6D)。此外，BC002811熒光原位雜交和SOX2免疫熒光顯示BC002811與SOX2在AGS和HGC-27細胞核中共定位（圖6E），表明BC002811可能通過與SOX2相互作用而在基因轉錄調控中發(fā)揮作用。PTEN是一個眾所周知的腫瘤抑制基因，已被證明是胃癌中SOX2轉錄調控的直接靶點。為了確定BC002811是否影響SOX2與PTEN啟動子的結合，染色質免疫沉淀（ChIP）和電泳遷移率移位測定（EMSA）分析在胃癌細胞中進行。ChIP檢測表明，敲低BC002811增強了SOX2與PTEN啟動子的結合（圖6F）。這也被EMSA進一步驗證（圖6G）。這些結果表明，BC002811可能作為SOX2的分子誘餌，直接與SOX2結合，從而阻止SOX2與PTEN啟動子結合。為了驗證BC002811是否通過SOX2介導抑制PTEN的表達，作者進行了挽救實驗。作者發(fā)現SOX2過表達在mRNA（圖6H）和蛋白水平（圖6I）逆轉了BC002811介導的PTEN表達降低。然而，敲低或上調BC002811均未改變SOX2 mRNA（圖6J）和蛋白表達（圖6K），因此排除了BC002811通過下調SOX2表達抑制PTEN轉錄的作用。綜上所述，這些數據表明BC002811可能通過與SOX2相互作用來抑制PTEN的轉錄。

圖6BC002811通過充當轉錄因子SOX2的分子誘餌抑制PTEN的轉錄

7. 聯合BC002811和PTEN表達可提高預后價值

作者通過免疫組化和qPCR檢測PTEN在胃癌組織芯片配對樣本和手術切除的胃癌樣本中的表達，以評估臨床樣本中BC002811和PTEN水平之間的病理相關性。作者發(fā)現PTEN蛋白在胃癌組織中的表達水平低于其配對的非腫瘤胃標本（圖7A-B）。同樣，PTEN的mRNA水平在胃癌樣本中也低于匹配的非腫瘤區(qū)域（圖7C）。相關性分析發(fā)現，BC002811的表達與PTEN蛋白（圖7D）和mRNA水平（圖7E）呈負相關，符合BC002811對PTEN表達的調控作用。PTEN表達對胃癌患者OS影響的結果顯示，PTEN低表達的胃癌患者預后稍差（圖7F）。為了獲得更好的臨床預后，作者根據BC002811和PTEN的表達水平將胃癌患者分為4個亞組。Kaplan-Meier分析顯示，這些亞組的生存模式顯著不同，其中BC002811表達上調和PTEN表達下調的患者的OS低于其他亞組（圖7G）。由于與低BC002811/高PTEN亞組相比，高BC002811/低PTEN亞組的OS顯著降低（圖7G），這表明BC002811和PTEN在胃癌預后中呈負相關。這些結果還突出了合適的胃癌預后特征的臨床價值，而聯合檢測BC002811和PTEN表達可實現這一目標。

圖7BC002811表達聯合PTEN表達的預后意義

結論：

該研究鑒定出BC002811是一個參與胃癌生長和轉移的致癌lncRNA。該研究結果表明，BC002811與SOX2結合，破壞SOX2與PTEN啟動子之間的相互作用，從而導致PTEN轉錄抑制。PTEN蛋白水平的降低可進一步刺激MMP2和MMP9的表達，最終促進胃癌細胞的轉移。該研究為腫瘤細胞BC002811靶向治療胃癌轉移提供了潛在的策略。

示意圖：

BC002811調控PTEN表達和胃癌轉移的模型。

參考文獻：

Lin X, Li G, Yan X, Fu W, Ruan J, Ding H, et al. Long non-coding RNA BC002811 Promotes Gastric Cancer Metastasis by Regulating SOX2 Binding to the PTEN Promoter.Int J Biol Sci. 2023 Jan 16;19(3):967-980. doi: 10.7150/ijbs.76407.