FASN通過調節(jié)脂質代謝重編程的致癌作用已在多種腫瘤中得到證實。然而，肝內(nèi)膽管癌（ICC）進展過程中的機制，如circRNAs，是否調節(jié)FASN的表達尚不清楚。在這里，作者證明一個脂質代謝相關的circRNA，circMBOAT2在ICC組織中頻繁上調，并且與ICC的惡性特征呈正相關。機制上，circMBOAT2與PTBP1結合，保護PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解，損害PTBP1將FASN mRNA從細胞核轉移到細胞質的功能。研究結果證實，circMBOAT2在ICC中表達上調，并通過穩(wěn)定PTBP1促進FASN mRNA胞質輸出促進ICC進展，從而改變ICC的脂質代謝輪廓和調節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)，提示circMBOAT2可能作為脂質代謝活躍的ICC的治療靶點。本研究于2023年1月發(fā)表于《Cell Death Dis》，IF：9.685。

技術路線：

主要研究結果：

1、  CircMBOAT2在ICC中上調，且與脂質代謝相關

代謝重編程是癌癥的標志，ICC也不例外。作者利用RNA - seq分析7個配對ICC樣本中circRNA的表達譜。在ICC組織中共鑒定出420個滿足以下條件的失調circRNA：（1） |平均標準化倍數(shù)變化|≥1；（2） P值< 0.05，其中82個上調，338個下調。接下來，通過GO和KEGG通路分析對所選circRNAs的基因功能進行闡釋。在KEGG通路分類分析中，'有機系統(tǒng)'（154個基因）和'代謝'（169個基因）類別占優(yōu)勢。在"代謝"類別中，"脂質代謝"包括31個基因（圖1A）。此外，KEGG富集分析表明篩選的circRNA主要與代謝相關，包括"亞油酸代謝"和"花生四烯酸代謝"（圖1B）。這些結果表明ICC中顯著差異的circRNAs與脂質代謝相關。在與脂質代謝相關的circRNAs中，circMBOAT2在ICC腫瘤與癌旁正常組織中差異最為明顯。作者隨后證實ICC與正常膽管組織/細胞之間的差異表達（圖1C-D）。Kaplan - Meier分析顯示circMBOAT2高表達與（P = 0.055）患者較短的OS相關（圖1E）。circMBOAT2由MBOAT2的第2至第3外顯子產(chǎn)生，長度為224nt。使用發(fā)散型和收斂型引物擴增繩頭插接結合位點和circMBOAT2全長，并通過Sanger測序驗證（圖1F）。通過circBase數(shù)據(jù)庫注釋PCR分析發(fā)現(xiàn)，circMBOAT2可以用gDNA中的發(fā)散引物、隨機六聚體反轉錄的c DNA和oligo（dT）引物擴增。然而，circMBOAT2只能在隨機六聚體反轉錄的cDNA中用收斂引物擴增，而不能用gDNA或oligo（dT）引物反轉錄的cDNA（圖1G）。抗RNase R核酸外切酶消化實驗證明circMBOAT2具有閉環(huán)結構（圖1H）。通過核質分離和FISH發(fā)現(xiàn)circMBOAT2在細胞質和細胞核中均有表達（圖1I-J）。這些結果表明circMBOAT2是一個在ICC中廣泛分布的circRNA。

圖1 CircMBOAT2在ICC中上調，且與脂質代謝相關

2、circMBOAT2促進體內(nèi)外ICC進程

為研究circMBOAT2在ICC進展中的功能作用，作者檢測7種細胞系中circMBOAT2的內(nèi)源性表達。結果顯示，circMBOAT2在QBC - 939、HCCC - 9810、RBE、CCLP1和FRH細胞中的表達高于正常膽管上皮細胞H69細胞（圖1D）。由于RBE和HCCC - 9810細胞是公認的，并且是ATCC細胞庫中唯一保留的兩種細胞系，因此在接下來的實驗中使用它們。

采用CCK-8、克隆形成、EdU細胞增殖實驗和流式細胞術進一步檢測敲低和過表達細胞系的生物學功能。這些結果表明，在RBE和HCCC - 9810細胞中，敲低circMBOAT2抑制細胞增殖和克隆形成，但促進細胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滯（圖2A-E）。為進一步研究敲低circMBOAT2抑制細胞增殖、凋亡和GO/G1期阻滯的機制，作者通過WB檢測關鍵調控因子的表達水平。circMBOAT2敲低顯著降低c - myc、Bcl - 2和cyclin D1蛋白水平，增加Bax蛋白水平（圖2F）。

為評估circMBOAT2在體內(nèi)的生物學功能，將不同克隆的RBE細胞接種于裸鼠皮下構建異種移植瘤模型。結果證實，干擾circMBOAT2的表達后，腫瘤生長明顯受到抑制（圖2G）。相反，與對照組相比，circMBOAT2高表達組的平均腫瘤體積和重量更大，腫瘤生長更快（圖2I）。由于sh-circMBOAT2組腫瘤組織體積較小，作者取其他3組材料進行IHC染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，上調circMBOAT2組增殖細胞（Ki67 +和PCNA +）比例增加（圖2H-J）。此外，作者在32例ICC患者組織中發(fā)現(xiàn)circMBOAT2與Ki - 67的表達具有顯著相關性（圖2K）。總之，這些發(fā)現(xiàn)暗示circMBOAT2促進ICC生長。

圖2 circMBOAT2促進體內(nèi)外ICC進程

3、CircMBOAT2調節(jié)脂質代謝重編程，尤其是不飽和脂質

由于circMBOAT2表達與脂質代謝相關，從RNA-seq的分析結果來看，作者使用BODIPY493/503探針檢測ICC細胞中中性脂滴含量。結果表明中性脂滴含量與circMBOAT2 的表達呈正相關（圖3A-B）。通過流式細胞儀進一步證實這一點（圖3C-D）。然后，作者對circMBOAT2敲低的細胞進行RNA - seq和非靶向脂質代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)circMBOAT2調節(jié)ICC中的脂質代謝重編程。GSEA顯示，在circ MBOAT2 KD的HCCC - 9810細胞中，不飽和脂肪酸途徑相關基因的生物合成受到影響（圖3E）。在GSEA分析中，作者還發(fā)現(xiàn)與DNA復制、細胞凋亡和細胞周期相關的基因也與circMBOAT2相關，進一步證明circMBOAT2促進ICC生長（圖3E）。非靶向脂質組學鑒定出474種脂質，分屬于14類（圖3F）。主成分分析（PCA）結果顯示，circMBOAT2 KD的HCCC - 9810細胞與陰性對照轉染細胞的脂質組學差異較大（圖3G）。circMBOAT2敲低的HCCC - 9810細胞中的脂質種類發(fā)生變化（圖3H），不飽和脂質與飽和脂質相比發(fā)生明顯的變化。因此，作者的數(shù)據(jù)表明circMBOAT2促進ICC脂質代謝重編程，尤其是不飽和脂質代謝重編程，這可能是ICC進展的一個特征。

圖3 CircMBOAT2調節(jié)脂質代謝重編程

4、CircMBOAT2在ICC細胞中與PTBP1相互作用

為探索circMBOAT2是否通過與蛋白質相互作用來實現(xiàn)其功能，作者進行RNA pull - down實驗來探索與之相關的蛋白質。RNA pull - down實驗中沉淀的蛋白用10 % SDS - PAGE分離，銀染檢測（圖4A）。利用LC-MS / MS對circMBOAT2探針下拉的蛋白進行鑒定，結果見圖4B。在這些蛋白中，FASN被發(fā)現(xiàn)是一種脂質代謝相關蛋白，可與正義和反義探針結合。另一種RNA結合蛋白PTBP1，已被報道在多種癌癥中調節(jié)糖代謝重編程，并與正義探針特異性相互作用。值得注意的是，在沉淀中沒有發(fā)現(xiàn)AGO2，進一步證實circMBOAT2不通過ceRNA機制發(fā)揮作用。作者進行WB分析，與LC - MS / MS結果一致，PTBP1和FASN均與circMBOAT2結合（圖4C）。通過RIP實驗，作者證實PTBP1特異性結合circMBOAT2而不是FASN（圖4D-E）。此外，作者在HCCC - 9810細胞系中進行RNA FISH免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)circMBOAT2與PTBP1在細胞質和細胞核中都存在共定位（圖4F）。與circMBOAT2的亞細胞定位一致，PTBP1也主要分布在細胞核中（圖4G）。這些結果表明circ MBOAT2通過與PTBP1結合發(fā)揮作用。

圖4CircMBOAT2在ICC細胞中與PTBP1相互作用

5、CircMBOAT2保護PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解

采用WB檢測RBE和HCCC - 9810細胞中circMBOAT2與PTBP1的關系。結果顯示，敲低circMBOAT2降低PTBP1蛋白水平，相反，過表達circMBOAT2增加PTBP1蛋白水平（圖5A-B）。通過IHC，作者發(fā)現(xiàn)circMBOAT2和PTBP1在32例ICC患者組織中的表達具有顯著相關性（圖5C）。值得注意的是，在過表達circMBOAT2的情況下，FASN蛋白水平升高，表明FASN可能以間接的方式被調控（圖5B）。然后作者在ICC細胞中進行PCR和WB分析，進一步檢測circMBOAT2和PTBP1之間的關系。為證實circMBOAT2不影響PTBP1的RNA穩(wěn)定性，作者進行RNA聚合酶II抑制劑放線菌素（ActD）追趕實驗。結果顯示，敲低circMBOAT2的細胞中PTBP1的mRNA水平無明顯變化（圖5D）。相反，用CHX處理后，作者發(fā)現(xiàn)敲低circMBOAT2增加PTBP1蛋白的半衰期（圖5E）。因此，作者推測circMBOAT2可能通過相互作用穩(wěn)定PTBP1蛋白。作者研究敲低circMBOAT2是否顯著降低PTBP1蛋白水平，而這種作用可以被蛋白酶體抑制劑MG132恢復（圖5F）。此外，免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，敲低circMBOAT2顯著增加PTBP1 （圖5G-H）的泛素化水平。這些結果表明circMBOAT2通過保護PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解來增加PTBP1的穩(wěn)定性。

圖5CircMBOAT2保護PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解

6、CircMBOAT2促進PTBP1介導的細胞質輸出FASN mRNA

作者通過RIP實驗證實PTBP1可以與FASN mRNA結合（圖6A）。為研究PTBP1與FASN mRNA結合后的功能，作者使用兩組siRNAs（siPTBP1 # 1和si - PTBP1 # 2）檢測PTBP1敲低后FASN mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)PTBP1敲低后沒有顯著差異（圖6B）。說明PTBP1不影響FASN mRNA的穩(wěn)定性。與在ICC細胞系中的表現(xiàn)一致，與癌旁非腫瘤組織相比，FASN的RNA水平在ICC組織和癌旁正常組織中無明顯差異（圖6C）。然而，FASN蛋白的表達水平與circMBOAT2顯著相關（圖6D）。在RBE和HCCC - 9810細胞中敲低PTBP1后，FASN的蛋白水平降低（圖6E）。為研究PTBP1是否介導FASN mRNA的選擇性剪接，作者從NCBI中查找FASN的剪接形式，設計含有該剪接區(qū)的引物。通過Sanger測序，作者發(fā)現(xiàn)敲低PTBP1后FASN的剪接形式?jīng)]有改變（圖6G）。因此，作者推測PTBP1可以促進FASN mRNA的胞質輸出。為驗證這一假設，作者進行核質分離和FISH實驗。有趣的是，作者觀察到PTBP1敲低后，RBE和HCCC - 9810細胞中細胞質FASN mRNA水平明顯降低（圖6F-I）。作者進一步研究PTBP1敲低對FASN表達的影響。PTBP1敲低消除circMBOAT2過表達對RBE中FASN表達的影響（圖6J）。這些結果表明，在ICC細胞中circMBOAT2通過與PTBP1相互作用促進細胞質輸出和FASN mRNA的表達。

圖6CircMBOAT2促進PTBP1介導的細胞質輸出FASN mRNA

7、花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）干預circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的ICC進展

作者接著研究circMBOAT2在ICC進展中的作用是否依賴于FASN通路。檢測si - FASN # 1、si - FASN # 2、si - FASN # 3三組siRNA的效率，均能降低FASN的表達（圖7A）。效率較高的si - FASN # 2和si - FASN # 3用于后續(xù)實驗。CCK - 8、Ed U細胞增殖實驗和流式細胞術的體外實驗表明，在RBE和HCCC - 9810細胞中，FASN表達降低抑制細胞增殖，促進早期和晚期凋亡以及GO/G1期阻滯（圖7B - E）。

接下來，作者通過脂質組學比較對照、circMBOAT2沉默或FASN沉默的ICC細胞之間的脂質水平。PCA分析表明，ICC細胞中FASN的下調與circMBOAT2沉默平行（圖7F）。這些數(shù)據(jù)表明circMBOAT2促進ICC進展的脂質代謝重編程功能依賴于FASN通路。因此，ICC細胞中不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸的水平發(fā)生顯著變化。

基于偏最小二乘判別分析（PLS-DA），作者發(fā)現(xiàn)兩種n - 6 PUFAs，花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）的比例在circMBOAT2沉默組和FASN沉默組中顯著降低（圖7G），因此作者探究這兩種n - 6 PUFAs在FASN介導的ICC進展中的功能。在體外，CCK - 8、EdU細胞增殖實驗和流式細胞術表明，FASN表達降低在功能上抑制HCCC - 9810細胞的增殖，促進細胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滯，這種作用可以被額外的花生四烯酸和腎上腺酸補充所逆轉（圖8A - C）。這初步表明花生四烯酸和腎上腺酸在ICC中FASN致癌性中的可能作用。

圖7花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）干預circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的ICC進展

8、CircMBOAT2通過FASN降低ICC細胞氧化應激

為進一步研究circMBOAT2參與的信號通路，作者對上述組織和細胞進行RNA - seq轉錄組測序。KEGG通路富集分析顯示circRNAs與細胞色素P450通路相關（圖1B）。與之一致，circMBOAT2 - KD觸發(fā)鐵死亡和NF - κ B信號通路（圖8D）。這些結果表明circMBOAT2參與調節(jié)ICC的氧化還原穩(wěn)態(tài)。至此，作者檢測HCCC - 9810細胞的脂質過氧化水平和活性氧（ROS）水平。流式細胞術結果顯示，過表達circMBOAT2抑制FASN - KD誘導的脂質過氧化和ROS產(chǎn)生（圖8E , F），這解釋之前敲低FASN和circMBOAT2誘導的細胞凋亡。超氧化物歧化酶（SOD1和SOD2）、谷胱甘肽過氧化物酶1 （GPX1）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、核因子E2相關因子2 （NRF2）和血紅素加氧酶1 （HO-1）的mRNA水平在FASN - KD細胞中顯著升高，當circMBOAT2過表達時恢復（圖8G）。此外，過表達circMBOAT2抑制FASN - KD促進的NRF2在ICC細胞中的表達（圖8H）。這些結果表明circMBOAT2促進ICC的脂質代謝重編程，該過程受circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的調控。

圖8 CircMBOAT2通過FASN降低ICC細胞氧化應激

圖9circMBOAT2促進ICC進展的工作模型。

結論

作者的研究首次提出ICC脂質代謝重編程受circMBOAT2調控，并與其進展相關。機制上，作者發(fā)現(xiàn)circMBOAT2結合并穩(wěn)定PTBP1，從而有助于FASN mRNA的胞質輸出。FASN的上調改變ICC的脂質代謝輪廓并調節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)。重要的是，作者的研究結果表明，沉默circMBOAT2為ICC治療提供新的治療策略。

參考文獻

Yu X, Tong H, Chen J, Tang C, Wang S, Si Y, Wang S, Tang Z. CircRNA MBOAT2 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression and lipid metabolism reprogramming by stabilizing PTBP1 to facilitate FASN mRNA cytoplasmic export. Cell Death Dis. 2023 Jan 12;14（1）:20. doi: 10.1038/s41419-022-05540-y. PMID: 36635270; PMCID: PMC9837196.