超過70%的胃癌（GC）新發病例發生在發展中國家，約50%發生在東亞。中國胃癌發病和死亡人數分別占全球統計數據的42.6%和45.0%，在183個國家中發病率排名第5，死亡率排名第6。因此探索GC的治療方法至關重要。作為一種新型的非編碼RNA，tRNA衍生物在GC中起著重要作用。然而tRNA衍生物參與GC的潛在機制很少被說明。該研究發表于《Cell Communication and Signaling》，IF：7.525。

研究路線：

主要研究結果：

1.胃癌組織tRFs和tiRNAs測序譜

研究者進行了tsRNAs測序，以區分差異表達的tsRNAs（DETs）和無差異表達的tsRNAs（NDETs），最終根據譜選擇tRF-Val-CAC-016。隨后，研究者應用層次聚類對DETs進行分類，共得到69個上調和42個下調的DETs的層次聚類熱圖（圖1a）。研究者使用火山圖來展示差異最大的DETs，根據圖譜的foldchange（FC）（log2FC≥3或log2FC≤-3，p<0.05），在圖1b中顯示了5個下調和6個上調的tsRNAs。顯然，考慮到可行性和統計學意義，研究者選擇tRF-Val-CAC-016進行進一步的研究。同時，研究者使用R gplot包完成了相關系數的熱圖來闡述GC樣品的相似性（圖1c）。

圖1 tRFs和tiRNA測序譜的GC組織

2.tRF-Val-CAC-016在胃癌組織中低表達

研究者應用凝膠電泳驗證tRF-Val-CAC-016的PCR產物，證明PCR引物的可行性，并驗證tsRNA測序的真實性（圖2a）。如圖2b所示，tRF-Val-CAC-016的長度在50-100 bp之間，研究者進行了Sanger測序驗證結果。熒光原位雜交檢測表明tRF-Val-CAC-016定位于細胞核和細胞質，但主要位于細胞質（圖2c）。隨后在胃癌細胞系中檢測tRF-Val-CAC-016的表達水平，最終選擇NCI-N87和HGC-27（圖2d）。最后，為了確認tRF-Val-CAC-016模擬物的效率，研究者進行了轉染，結果與研究者的預期一致（圖2e）。類似地，在40對胃癌組織中也證實了低表達水平（圖2f）。同時，在臨床病理特征方面，tRF-Val-CAC-016的表達與腫瘤大小和組織學類型顯著相關。進一步通過對胃切除術后患者的隨訪，計算tRF-Val-CAC-016的預后結局，但結果并不顯著（圖2g）。

圖2 tRF-Val-CAC-016在GC組織中的表達顯著降低

3.tRF-Val-CAC-016抑制胃癌細胞增殖

如圖3a-b所示，tRF-Val-CAC-016在CCK-8實驗中顯著抑制胃癌細胞的增殖。乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）實驗表明，tRF-Val-CAC-016可以抑制GC的細胞復制活性，而tRF-Val-CAC-016抑制劑增強了GC的復制活性（圖3c-d）。同時，研究者發現tRF-Val-CAC-016可以調節胃癌細胞周期的檢查點。如圖3e-g所示，奧沙利鉑在GC中主要處理G1期。而tRF-Val-CAC-016對NCI-N87和HGC-27細胞的S期均有顯著的調節作用。集落形成實驗中，tRF-Val-CAC-016對胃癌細胞活力的抑制作用略弱于奧沙利鉑。tRF-Val-CAC-016抑制劑增強了GC細胞中的集落形成能力（圖3h-i）。這些現象在免疫印跡實驗中得到了嚴格的解釋，如圖3j-k所示，tRF-Val-CAC-016模擬物明顯降低了CyclinD1, CyclinB, c-myc的蛋白表達。tRF-Val-CAC-016抑制劑可上調CyclinD1、CyclinB、c-myc蛋白表達。與對照組相比，奧沙利鉑降低了CyclinD1、c-myc的表達。

圖3tRF-Val-CAC-016抑制了GC的增殖

4.生物信息學分析

應用miRanda和TargetScan數據庫預測tsRNAs的靶基因?；?/span>mRNA和tsRNAs表達譜數據的匹配，揭示了一些具有顯著性的生物學位點-序列特征和相對保守的評分模型。結構評分（structure score）、能量（energy）、context_plus_score等參數用于優化tsRNAs靶基因的選擇。然后對下調或上調的tsRNAs靶基因進行GO和KEGG富集分析。下調組GO分析如圖4a-c所示，研究者發現MAPK信號通路顯著富集（圖4d）。在上調組中，GO分析如圖4e-g所示，研究者發現Wnt信號通路相當突出（圖4h）。然后，研究者將本研究中的生物信息學數據與GEO和TCGA數據庫進行了比較，結果表明增殖相關通路經常被富集，并且揭示了鈣信號通路，這與CACNA1d的功能一致。

圖4測序譜的GO和KEGG富集分析

5.驗證了CACNA1d在胃癌組織中表達上調，并選擇作為tRF-Val-CAC-016的潛在靶點

研究者引入TCGA和GEO數據庫預測可能的靶點進行進一步研究。如圖5a所示，維恩圖取MAPK組與tRF-Val-CAC-016預測靶基因的重疊。然后研究者分析了GEO數據庫（GSE65801）和TCGA-STAD數據庫，發現GSE65801中的CACNA1d、PLA2G4A和TNF(圖5b)，TCGA-STAD中的CACNA1d和PLA2G4A顯著上調（圖5c）。研究者進一步應用Kaplan-Meier plotter網站，發現CACNA1d, TNF, TGFBR1, PDGFC, GADD45B與胃癌預后顯著且反相關（圖5d-l）。上述分析提示了CACNA1d作為tRF-Val-CAC-016可能的下游靶點的重要作用。隨后，研究者獲得了90對GC標本的組織微陣列（tissue microarray, TMA），包括詳細的隨訪數據（圖5m）。IHC結果見圖5n。通過對隨訪數據的分析，研究者發現CACNA1d的表達與胃癌的預后無關（p=0.1805，圖5o）。GC和NATs的代表性IHC圖像示于圖5p中。CACNA1d在胃癌組織中的蛋白水平顯著上調（圖5q）。綜合分析結果取交集，選擇CACNA1d作為靶基因。為了驗證CACNA1d的表達和功能，研究者購買了針對CACNA1d的siRNA，并選擇si-CACNA1d-1作為相比si-CACNA1d-2和si-CACNA1d-3抑制效果更好的siRNA（圖5r）。相反，pcDNA-CACNA1d可顯著增強CACNA1d的表達（圖5s）。此外，tRF-Val-CAC-016抑制劑能夠在一定程度上逆轉si-CACNA1d對GC細胞的抑制功能（圖5t）。類似地，pcDNA-CACNA1d對GC的作用被tRF-Val-CAC-016 mimics部分緩解（圖5u）。

圖5驗證CACNA1d在GC組織中被上調，并選為tRF-Val-CAC-016的潛在靶標

6.Argonaute-2可免疫共沉淀tRF-Val-CAC-016, tRF-Val-CAC-016可通過靶向CACNA1d調節胃癌細胞增殖

測序圖譜闡明了tRF-Val-CAC-016與CACNA1d mRNA之間可能的結合關系（圖6a）， tRF-Val-CAC-016模擬物可以顯著降低RT-PCR中CACNA1d的表達（圖6b）。tRF-Val-CAC-016模擬物可降低CACNA1d的蛋白水平，tRF-Val-CAC-016抑制劑可促進CACNA1d的蛋白水平（圖6c）。隨后，研究者發現WT-CACNA1d -3 ' UTR + tRF-Val-CAC-016 mimics組在雙熒光素酶報告實驗中與其他組相比，可以顯著降低熒光素酶比率（圖6d）。然后，研究者引入RIP（RNA結合蛋白免疫沉淀）測定，發現與IgG組相比，tRF-Val-CAC-016被Argonaute-2顯著免疫沉淀（圖6e）。凝膠電泳進一步驗證了RIP檢測的PCR產物（圖6f）。此外，免疫印跡證實了清洗磁珠過程的完整性（圖6g）。

圖6tRF-Val-CAC-016被Argonaute-2免疫沉淀，可通過靶向CACNA1d調節GC的增殖

7.CACNA1d可促進胃癌細胞的增殖，并可被tRF-Val-CAC-016調控

挽救實驗進一步闡明了tRF-Val-CAC-016和CACNA1d之間的聯系。在CCK-8實驗中，si-CACNA1d可以顯著降低胃癌細胞的增殖，tRF-Val-CAC-016抑制劑可以部分恢復胃癌細胞的增殖（圖7a-b）。在EdU實驗中，tRF-val-cac016抑制劑可以挽救si-CACNA1d對細胞復制活性的抑制作用（圖7c-d）。有趣的是，si-CACNA1d導致HGC-27細胞的G1期阻滯，而NCI-N87細胞的S期阻滯，并且兩者都可以被tRF-Val-CAC-016抑制劑挽救（圖7e-g）。同樣，tRF-Val-CAC-016抑制劑對si-CACNA1d的挽救作用也在克隆形成實驗中得到了證實（圖7h-i）。si-CACNA1d對CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc蛋白表達的抑制作用被tRF-Val-CAC-016抑制劑部分恢復（圖7j-k）。同樣，對CACNA1d的功能進行反向驗證。分別轉染pcDNA-CACNA1d和pcDNA-CACNA1d + tRF-Val-CAC-016 mimics。如圖8a-i所示，tRF-Val-CAC-016 mimics可以顯著逆轉pcDNA-CACNA1d對胃癌細胞增殖的增強作用。pcDNA-CACNA1d顯著提高了CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc的蛋白水平，而tRF-Val-CAC-016 mimics可降低這一功能（圖8j-k）。

圖7si-CACNA1d抑制GC增殖，可被tRF-Val-CAC-016抑制劑挽救

圖8pcDNA-CACNA1d增強了GC的增殖，并通過tRF-Val-CAC-016模擬物進行了調節

8.MAPK信號通路抑制劑（p38 MAPK-IN）可逆轉tRF-Val-CAC-016抑制劑對胃癌細胞增殖的促進作用

為了證明MAPK信號通路的作用，研究者使用p38 MAPK-in來挽救tRF-Val-CAC-016抑制劑對胃癌增殖的增強作用。這表明p38 MAPK-IN能夠部分阻斷該通路的傳導，表現為tRF-Val-CAC-016抑制劑對胃癌的影響減弱。如圖9a-b所示，在CCK-8實驗中，tRF-Val-CAC-016抑制劑增強了GC的增殖，p38 MAPK-IN可以部分逆轉這一作用。同時，tRF-Val-CAC-016抑制劑促進了細胞的復制活性，p38 MAPK-IN也可以降低這種活性（圖9c-d）。流式細胞術檢測細胞周期（圖9e-g）和免疫印跡法檢測CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc（圖9h-i）也發生了逆轉現象。

圖9MAPK信號通路抑制劑（p38 MAPK-IN）顯著逆轉了tRF-Val-CAC-016抑制劑對GC增殖的增強

9.tRF-Val-CAC-016抑制NCI-N87移植瘤的增殖

皮下移植實驗探討tRF-Val-CAC-016在體內的作用。結果表明，在異種移植物的體重和腫瘤體積方面，tRF-Val-CAC-016降低了小鼠的腫瘤生長能力（圖10a-d）。這些切除腫瘤的PCR結果顯示，與激動劑對照組和生理鹽水（NS）組相比，tRF-Val-CAC-016激動劑顯著抑制了增殖（圖10e），這也發生在這些小鼠腫瘤的免疫印跡試驗中（圖10f）。此外，對ki-67和CACNA1d的免疫熒光染色實驗表明，tRF-Val-CAC-016降低了胃癌的增殖能力，進一步證實了CACNA1d蛋白的表達和定位（圖10g-h）。同時，免疫組織化學（IHC）檢測也證明了在tRF-Val-CAC-016激動劑組中CACNA1d的低表達（圖10i）。

圖10tRF-Val-CAC-016抑制NCI-N87異種移植物中的腫瘤增殖

10.tRNA衍生物tRF-Val-CAC-016通過靶向CACNA1d調節經典MAPK信號通路

如圖11a所示，機理圖清楚地解釋了tRF-Val-CAC-016對MAPK信號通路的影響模式。在NCI-N87的免疫印跡實驗中，tRF-Val-CAC-016模擬物抑制CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK和p-p38的表達。tRF-Val-CAC-016抑制劑增強了CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-JNK、p38、cyclinB、cyclinD1、c-myc的表達（圖11b）。si-CACNA1d可抑制CACNA1d（Cav1.3）、JNK、p-p38、cyclinD1和c-myc的表達水平，該作用可被tRF-Val-CAC-016抑制劑逆轉（圖11c）。pcDNA-CACNA1d增加了CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1和c-myc的表達，這些表達被tRF-Val-CAC-016模擬物拯救（圖11d）。在HGC-27中，tRF-Val-CAC-016模擬物降低，而tRF-Val-CAC-016抑制劑促進了CACNA1d （Cav1.3）、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1、c-myc的蛋白水平（圖11e）。si-CACNA1d下調CACNA1d（Cav1.3）、ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB和cyclinD1，該作用可被tRF-Val-CAC-016抑制劑逆轉（圖11f）。pcDNA-CACNA1d增強CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1和c-myc，而tRF-Val-CAC-016 mimics則表現出減弱作用（圖11g）。

圖11tRNA衍生物tRF-Val-CAC-016通過靶向CACNA1d調節MAPK信號通路

結論：

本研究首次闡明了tRF-Val-CAC-016在胃癌中的功能。對tRF-Val-CAC-016參與機制的討論在一定程度上較為全面。tRF-Val-CAC-016在胃癌組織中表達顯著下調，臨床病理分析顯示其表達與組織學類型和腫瘤大小相關。此外，tRF-Val-CAC-016通過調節CACNA1d介導的MAPK信號通路的轉導而抑制胃癌的增殖。綜上所述，tRF-Val-CAC-016有望成為胃癌潛在的診斷標志物和新的治療靶點。

參考文獻：

Xu W, Zheng J, Wang X, Zhou B, Chen H, Li G, Yan F. tRF-Val-CAC-016 modulates the transduction of CACNA1d-mediated MAPK signaling pathways to suppress the proliferation of gastric carcinoma. Cell Commun Signal. 2022 May 19;20(1):68. doi: 10.1186/s12964-022-00857-9.