胃腺癌(STAD)是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。轉移和耐藥是目前化療失敗的兩個主要原因。在這里，我們發現Rab31在人類STAD組織中表達上調，Rab31的高表達與低生存率密切相關。此外，我們發現Rab31促進人類STAD細胞的順鉑耐藥和轉移。降低Rab31表達誘導STAD細胞凋亡，增加順鉑敏感性；Rab31過表達的結果相反。Rab31的沉默阻止了STAD細胞的遷移，而Rab31的過表達增加了轉移潛力。進一步的研究表明Rab31通過上皮-間充質轉化(EMT)途徑介導順鉑耐藥和轉移。此外，我們發現Rab31過表達和順鉑處理都會導致Twist1表達增加。Twist1的缺失增強了STAD細胞對順鉑的敏感性，這不能通過Rab31的過表達完全逆轉。Rab31通過激活Stat3和抑制MUC-1激活Twist1。本研究還表明，敲除Rab31可抑制STAD模型小鼠的腫瘤生長。這些結果表明Rab31是一種新的、有前景的生物標志物和潛在的治療靶點，可用于STAD的診斷、治療和預后預測。我們的數據不僅發現了一種新的Rab31/Stat3/MUC-1/Twist1/EMT通路在STAD轉移和耐藥中的作用，而且為未來探索預測和治療STAD的新策略提供了方向。本文于2023年2月發表于“Cell Death and Disease”（IF=9.685）上。

技術路線

結果

1）Rab31高表達與STAD患者預后不良相關

我們通過分析TCGA數據庫中408個STAD組織和211個正常組織的RNA-Seq數據來評估Rab31的mRNA水平。與正常組織相比，STAD腫瘤組織中Rab31的表達明顯升高(圖1A)，并且隨著STAD從I期到IV期的進展，Rab31的表達增加，在IV期Rab31的表達最高(圖1B)。此外，Rab31水平高的STAD患者OS較差(圖1C)。為了進一步評估Rab31在STAD中的表達，我們采用免疫組化方法檢測了人STAD組織芯片中Rab31的蛋白水平。與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中Rab31明顯上調(圖1D, E)。我們還通過western blot檢測了臨床收集的組織中Rab31蛋白的水平，證實在STAD組織中Rab31明顯高于相應的正常組織(圖1F)。Rab31水平高的患者10年生存率為43%，Rab31水平低的患者10年生存率為57%，進一步證實了Rab31水平高與STAD患者生存率差密切相關(圖1G-H)。這些數據表明，Rab31在STAD組織中表達上調，其高表達與STAD患者預后不良相關。

2）Rab31促進人STAD細胞的細胞遷移和調節順鉑敏感性

鑒于對順鉑耐藥是STAD預后不良的一個主要原因，我們試圖確定Rab31是否參與了STAD的順鉑耐藥。我們利用了三種人STAD細胞系：MGC-803、BGC-823和AGS。Rab31在MGC-803細胞中表達最低，AGS細胞中表達最高(圖2A)。順鉑治療后，所有三種人STAD細胞的細胞活力均呈劑量依賴性下降(圖2B，左)。有趣的是，AGS細胞對順鉑的耐藥性最高(圖2B，右)。IC50與Rab31表達水平呈顯著正相關(圖2C)。這些結果提示Rab31的表達可能會限制順鉑在STAD細胞中的抗腫瘤活性。為了測試Rab31是否抑制順鉑的有效性，我們首先檢測了Rab31在順鉑處理的細胞中的表達是如何改變的。western blot結果顯示，在順鉑處理的三種人STAD細胞系中，Rab31蛋白水平均顯著升高(圖2D)。在三種STAD細胞中，過表達Rab31的細胞(Rab31OE)均顯示Rab31蛋白水平顯著升高，Rab31 siRNA顯著降低Rab31的表達(圖2E, F，下)。Rab31過表達導致順鉑處理的所有三種STAD細胞系的劑量-反應曲線向上移位，這表明Rab31的增加增強了順鉑處理的STAD細胞的細胞活力(圖2E，上)。此外，三種STAD細胞系Rab31表達的降低導致順鉑治療劑量-反應曲線向下移位，表明Rab31低表達可增加順鉑敏感性(圖2F，上)。通過Annexin V/PI染色檢測細胞凋亡，進一步檢測Rab31表達對順鉑耐藥的影響。在IC50濃度順鉑作用48 h后，所有STAD細胞均發生早期和晚期凋亡(圖2G)。Rab31下調顯著增加順鉑誘導的凋亡。有趣的是，這種效應在內源性Rab31水平較高的AGS細胞中最為明顯(圖2H)。此外，過表達Rab31在這三種細胞系中都減少了順鉑誘導的凋亡。接下來，我們通過集落形成法和transwell法研究Rab31對STAD細胞長期增殖能力和轉移的影響。Rab31的下調抑制了所有三種STAD細胞系的集落形成，而Rab31的過表達則促進了腫瘤集落的形成(圖2I-2L，上)。在transwell試驗中，Rab31的沉默阻止了STAD細胞的遷移，而Rab31的過表達增加了轉移潛力(圖2I-2L，下)。結果表明Rab31可能促進人STAD細胞的克隆性生長和轉移。

3）Rab31通過EMT促進轉移和順鉑耐藥

在人類癌癥中，EMT是一個與腫瘤進展、轉移和治療耐藥性相關的關鍵細胞過程。為了確定EMT是否參與了Rab31誘導的STAD轉移和順鉑耐藥，我們在人類STAD細胞系中檢測了Rab31表達改變時上皮細胞標志物和間充質細胞標志物的表達。如圖3A所示，在所有三種STAD細胞系中，Rab31的下調導致上皮標志物E-cadherin蛋白表達水平升高，間充質標志物(vimentin, MMP-2和MMP-9)表達降低。相反，Rab31過表達導致EMT表現為vimentin、MMP-2和MMP-9表達增加，E-cadherin表達缺失(圖3C)。然后我們探討了順鉑治療如何影響EMT。IC50濃度的順鉑作用于人STAD細胞24小時后，E-cadherin表達降低，vimentin表達增加，提示順鉑誘導EMT(圖3B，D)， Rab31 siRNA逆轉順鉑誘導的EMT過程。這些結果表明，順鉑治療期間Rab31表達增加可能促進EMT，從而增強STAD細胞的遷移和轉移能力，導致順鉑耐藥。

4）Rab31通過靶向MUC-1促進twist1介導的EMT

為確定可能參與Rab31介導的STAD順鉑耐藥的EMT-TFs，利用GEPIA在線工具計算EMT-TFs表達與Rab31的相關性。結果顯示，EMT-TFs (TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2)與Rab31呈正相關(補充圖)。大量研究報道，與非癌性組織相比，Twist1在STAD中過表達，且Twist1高表達與進展不良相關。然后，我們檢測Twist1是否是連接Rab31與EMT和順鉑耐藥的關鍵因子。Western Blot結果顯示，順鉑作用于AGS細胞后，Rab31和Twist1的表達呈時間依賴性增加(圖4a)。此外，敲低Rab31可降低AGS細胞中Twist1 mRNA的表達(圖4B)， Twist1與Rab31的表達水平呈正相關(圖4C)。有研究表明沉默MUC1-C可以抑制Twist1，從而逆轉三陰性乳腺癌中的紫杉醇耐藥。在這里，我們研究了STAD細胞中MUC-1是否參與Rab31-Twist1信號軸。過表達Rab31導致AGS細胞中Twist1蛋白水平上調，MUC-1蛋白水平下調，而敲低Rab31則降低Twist1蛋白水平，MUC-1蛋白水平升高(圖4D)。此外，通過western blot檢測，MUC-1的敲除增加了AGS細胞中Twist1和Rab31的表達，而MUC-1/Rab31的雙敲除逆轉了這些變化(圖4E)。這些數據表明Rab31可能通過抑制MUC-1激活Twist1(圖4I)。然而，共免疫沉淀顯示Rab31在AGS細胞中不直接與Twist1或MUC-1相互作用(補充圖)。先前的研究報道MUC-1可以通過Stat3起作用。我們的數據顯示Rab31直接與Stat3相互作用(圖4F)。此外，Rab31敲低導致Stat3和p-Stat3蛋白水平下調，而過表達Rab31則增加了AGS細胞中Stat3和p-Stat3蛋白的表達(圖4G)。通過western blot檢測，Stat3敲低能夠下調Stat3水平，增加AGS細胞中MUC-1的表達，而過表達Rab31則逆轉了這些變化(圖4H)。我們的結果表明MUC-1是Stat3的下游靶點。接下來，我們研究了Rab31/Stat3/MUC-1/Twist1信號通路與STAD順鉑耐藥的關系。Twist1沉默增強了STAD細胞順鉑誘導的死亡(圖4J, K)。Rab31過表達僅輕微逆轉了Twist1敲低的作用。

5）Rab31沉默在體內抑制腫瘤生長

最后，我們探究了Rab31表達水平對體內腫瘤生長的影響。動物實驗流程如圖5A所示。與對照組相比，敲低Rab31抑制腫瘤生長的效果與順鉑治療相當(圖5B, E)。順鉑聯合Rab31 siRNA治療對腫瘤生長的抑制作用最強(圖5B, C)。不同治療組之間體重無差異，說明腫瘤大小的變化不是由于體重的變化(圖5D)。腫瘤組織HE染色和Ki67染色檢測腫瘤細胞增殖情況。同時使用順鉑和Rab31敲低治療可以顯著減少腫瘤細胞的增殖(圖5F, G)，提示Rab31是一個潛在的治療靶點，可以與順鉑聯合治療STAD。

結論：

     Rab31通過Stat3/MUC-1/Twist1介導的EMT促進STAD細胞的轉移和對順鉑治療的耐藥性。我們的數據不僅確定了STAD轉移和耐藥性的新途徑，而且還指導我們探索未來預測和治療STAD的新策略。

參考文獻：

Chen K, Xu J, Tong YL, Yan JF, Pan Y, Wang WJ, Zheng L, Zheng XX, Hu C, Hu X, Shen X, Chen W. Rab31 promotes metastasis and cisplatin resistance in stomach adenocarcinoma through Twist1-mediated EMT. Cell Death Dis. 2023 Feb 13;14(2):115. doi: 10.1038/s41419-023-05596-4.