類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜組織腫瘤樣增生，持續(xù)性滑膜炎癥，骨侵蝕和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通常發(fā)生在中年女性中。目前，RA的發(fā)展歸因于遺傳和環(huán)境因素，如吸煙，肥胖，壓力，神經(jīng)抑郁和女性荷爾蒙。RA患者發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)高于一般人群。最近，RA患者的臨床癥狀和并發(fā)癥的管理越來(lái)越受到醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注。深入了解RA發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制有助于及早發(fā)現(xiàn)RA及其并發(fā)癥，以便采取措施控制疾病的發(fā)展并減少疾病的活動(dòng)。該研究發(fā)表于《Frontiers in Immunology》，IF：8.786。

技術(shù)路線：

研究示意圖：

圖1 研究示意圖

主要研究結(jié)果：

1. 使用m6A調(diào)節(jié)器的RA分類方法的性能

考慮到m6A甲基化調(diào)節(jié)劑在腫瘤和免疫疾病進(jìn)展中的重要作用，作者使用公共數(shù)據(jù)集全面探討了19種m6A甲基化調(diào)節(jié)劑對(duì)RA診斷的重要性。基于這19種m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，使用五種不同的機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建了疾病診斷模型（RA與非RA）：使用Boruta，Rpart，LASSO，XGBoost和邏輯回歸的隨機(jī)森林優(yōu)化。除Rpart模型外，所有模型的精度和AUC均大于0.8。為了比較每種機(jī)器學(xué)習(xí)方法的性能，作者觀察了每個(gè)模型作為驗(yàn)證集中分類器的性能。驗(yàn)證集中每種機(jī)器學(xué)習(xí)方法的性能也是可變的（圖2A-F）。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集1中，邏輯回歸模型和LASSO_λ-min 模型的 AUC 最高（0.90），但 LASSO_λ-min 模型的準(zhǔn)確度更高（0.901）。Rpart模型的AUC最低（0.8）。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集2中，LASSO_λ-min 模型和 LASSO_λ-1se 模型的準(zhǔn)確度最高（0.89）和 AUC（0.88）。在這些模型中，Rpart模型的性能最差。此外，每種機(jī)器學(xué)習(xí)方法選擇的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑數(shù)量不同，Boruta選擇最多（14個(gè)調(diào)節(jié)劑），Rpart模型僅選擇一個(gè)調(diào)節(jié)劑。考慮到每種機(jī)器學(xué)習(xí)方法在驗(yàn)證集中的性能及其在模型中選擇的調(diào)節(jié)器數(shù)量，LASSO_λ-1se模型不僅在驗(yàn)證集中表現(xiàn)更好，而且在變量篩選方面也表現(xiàn)出更嚴(yán)格的要求。這些結(jié)果表明，LASSO_λ-1se模型具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和實(shí)用性。因此，作者進(jìn)一步比較了LASSO_λ-1se模型在全血樣品中的性能，并計(jì)算出AUC值為0.83（圖2G），進(jìn)一步提示LASSO_λ-1SE模型在基于血液的RA診斷中具有臨床應(yīng)用前景。

圖2 驗(yàn)證集1和驗(yàn)證集2的ROC曲線，模型在單獨(dú)的集上訓(xùn)練

2. RA分類中更重要的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑

通過(guò)這些多變量機(jī)器學(xué)習(xí)方法選擇不同的候選生物標(biāo)志物。然而，生物標(biāo)志物通常具有相同的準(zhǔn)確性和重要性。考慮到Rpart模型的性能最差，作者專注于不同機(jī)器學(xué)習(xí)方法選擇的重疊m6A甲基化調(diào)節(jié)因子，包括使用Boruta，LASSO，XGBoost和邏輯回歸（圖3A）。每種型號(hào)都選擇了兩種重疊的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑：IGF2BP3和YTHDC2。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步比較了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平。IGF2BP3和YTHDC2在RA和非RA患者中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。更重要的是，基于轉(zhuǎn)錄水平，IGF2BP3和YTHDC2在訓(xùn)練集中的RA診斷中也表現(xiàn)良好（圖3C），AUC值分別為0.85和0.75。此外，當(dāng)Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計(jì)算了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的重要性，IGF2BP3和YTHDC2排名較高；IGF2BP3 具有最高的重要性。

圖3 在RA分類中比較重要的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑

3. IGF2BP3在RA-FLS的活力和細(xì)胞周期中的重要性

根據(jù)途徑富集分析結(jié)果，IGF2BP3和YTHDC2與細(xì)胞周期密切相關(guān)。但是，當(dāng)Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計(jì)算了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的重要性，IGF2BP3排名第一，YTHDC2排名較低。此外，與YTHDC2相比，IGF2BP3對(duì)RA的診斷效能更好（圖3C）。因此，作者通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了IGF2BP3對(duì)RA-FLSs活力和細(xì)胞周期的調(diào)控作用。為了探索IGF2BP3對(duì)RA-FLS的影響，將siRNA轉(zhuǎn)染到RA-FLS中。RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)了轉(zhuǎn)染結(jié)果，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖4B-D）。然后，作者研究了IGF2BP3對(duì)體外RA-FLS活力的影響。CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)定顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調(diào)顯著降低了細(xì)胞活力（P<0.05，圖4E）。細(xì)胞增殖測(cè)定還顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調(diào)顯著抑制了細(xì)胞增殖（P<0.05，圖4F）。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，IGF2BP3的低表達(dá)對(duì)G2/M通道有明顯影響。與對(duì)照組相比，siIGF2BP3組G2/M期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05，圖4G，H）。作者還測(cè)量了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明siIGF2BP3降低了CCNB1和C-MYC的表達(dá)（圖4C，D）。此外，檢測(cè)OA（osteoarthritis）和RA患者滑膜組織中IGF2BP3的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織中IGF2BP3表達(dá)顯著較高，進(jìn)一步證實(shí)了 IGF2BP3 在 RA 進(jìn)展中的重要性（圖4I）

圖4 IGF2BP3在RA-FLS的活力和細(xì)胞周期中的重要性

4. IGF2BP3表達(dá)與炎癥活性的相關(guān)性

為了鑒定RA中IGF2BP3相關(guān)的免疫特征，作者用xCell確定了免疫評(píng)分和免疫細(xì)胞的比例。首先，作者發(fā)現(xiàn)兩組之間的免疫評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RA患者組的免疫評(píng)分高于NC患者組（P<0.001；圖5A）。然后，比較兩組免疫細(xì)胞的比例。許多免疫細(xì)胞的比例存在顯著差異，包括指間細(xì)胞（IDC）、自然殺傷T（NKT）細(xì)胞、經(jīng)典樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC）、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和肌細(xì)胞（圖5B，C）。在這些細(xì)胞類型中，作者專注于M1巨噬細(xì)胞，因?yàn)?/span>M1巨噬細(xì)胞與RA之間存在密切關(guān)系。RA患者M1巨噬細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照患者。此外，作者研究了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者M1巨噬細(xì)胞比例與IGF2BP3表達(dá)水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖5D）。IGF2BP3表達(dá)也與M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)顯著相關(guān)，包括IL1A、CD86和TLR2（圖5E-G）。因此，作者認(rèn)為IGF2BP3可以參與M1巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步探索IGF2BP3對(duì)M1巨噬細(xì)胞極化的影響，作者用Igf2bp3-siRNA或NC-siRNA（陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)染了RAW264.7細(xì)胞。通過(guò)RT?qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)了基因沉默的效率，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖5H，I）。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用100ng/ml LPS處理RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)。然后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD86）的表達(dá)，作者發(fā)現(xiàn)CD86在siIgf2bp3細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于siNC細(xì)胞（圖5J）。此外，作者進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞上清液中TNF-a的含量，這表明siIgf2bp3細(xì)胞中TNF-a的含量低于siNC細(xì)胞（圖5K）。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了IGF2BP3參與M1巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)。

圖5 IGF2BP3表達(dá)與炎癥活性之間的相關(guān)性

5. scRNA-seq揭示了IGF2BP3表達(dá)與M1巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系

為了進(jìn)一步確定IGF2BP3表達(dá)和M1型巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系，我們?cè)?/span>GSE159117數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了scRNA-seq。通過(guò)統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）分析得到14個(gè)細(xì)胞簇（圖6A）。SingleR（版本1.8.1）用于鑒定7種細(xì)胞類型：B細(xì)胞，CD4 T細(xì)胞，CD8 T細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，單核細(xì)胞，NK細(xì)胞和T細(xì)胞（圖6B）。發(fā)現(xiàn)IGF2BP3主要在七種細(xì)胞類型（圖6C）。巨噬細(xì)胞是來(lái)源于單核細(xì)胞的主要細(xì)胞類型。因此，探討CD86與IGF2BP3在單核細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD86和IGF2BP3具有共表達(dá)趨勢(shì)（圖6D）。然后，作者初步研究了幾種巨噬細(xì)胞標(biāo)志物在單核細(xì)胞中的表達(dá)。M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（包括CD86，IL1B，TLR2和TLR4）在單核細(xì)胞中顯著上調(diào)，但M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（包括MSR1，IL10，MMP14和VEGFA）下調(diào)（圖6E）。

圖6 UMAP圖顯示了收集的scRNA-seq細(xì)胞樣品的來(lái)源

結(jié)論：

該研究首次證實(shí)了m6A閱讀器蛋白IGF2BP3對(duì)RA進(jìn)展的影響，并通過(guò)生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其生物學(xué)功能。該研究為RA的早期診斷和靶向治療提供了新的思路和策略，具有理論創(chuàng)新前景。此外，它還為發(fā)現(xiàn)RA的新標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)提供了理論支持。

參考文獻(xiàn)：

Geng Q, Cao X, Fan D, Gu X, Zhang Q, Zhang M, Wang Z, Deng T, Xiao C. Diagnostic gene signatures and aberrant pathway activation based on m6A methylation regulators in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 2022 Dec 13;13:1041284. doi: 10.3389/fimmu.2022.1041284. PMID: 36582238; PMCID: PMC9793088.