腫瘤相關因子的轉錄后修飾在乳腺癌進展中起著關鍵作用。然而，潛在的機制仍然未知。癌細胞中的m6A修飾是動態和可逆的，并已發現通過各種機制影響腫瘤的發生和進展。本研究探討了Hippo通路中m6A甲基化對乳腺癌細胞增殖和代謝的調控機制。我們通過Hippo通路因子LATS1證明m6A調控在乳腺癌的增殖和糖酵解代謝中發揮重要作用。METTL3被鑒定為m6A的writer，YTHDF2被鑒定為LATS1 mRNA的閱讀蛋白，在乳腺癌的腫瘤發生和糖酵解中都有積極的促進作用。METTL3在LATS1 mRNA中誘導了高水平的m6A修飾。YTHDF2識別了LATS1 mRNA中的m6A位點，降低了其穩定性。敲除METTL3或YTHDF2蛋白表達，通過激活Hippo通路中的YAP/TAZ，增加LATS1 mRNA的表達，抑制乳腺癌的腫瘤發生。綜上所述，我們發現METTL3-LATS1-YTHDF2通路通過激活Hippo通路中的YAP/TAZ在乳腺癌的進展中發揮重要作用。本文于2023年1月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術路線

結果：

1）乳腺癌中m6A修飾的mRNA的異常表達與Hippo通路有關

為了研究乳腺癌組織樣本中m6A修飾水平，對配對的乳腺導管癌組織和相鄰的正常乳腺組織樣本進行MeRIP-seq。通過分析測序數據，我們發現癌組織中存在大量差異甲基化或修飾的mRNAs(圖1a)。每一對的差異富集峰顯示，腫瘤組織中超過一半的m6A特異性位點富集，并出現在經典的mRNA修飾區域附近，即外顯子、3 ' UTR和終止密碼子(圖1b)。圖1c顯示了差異表達的m6A mRNA與差異表達基因的聯合分析結果。對這些差異表達基因的功能富集分析(圖1d)進一步揭示m6A修飾在調控多種癌癥和信號通路中發揮重要作用，如MAPK，Hippo和PI3K-Akt信號通路。值得注意的是，Hippo途徑中的基因被發現在乳腺癌組織中有差異的修飾和表達(圖1d)。Hippo通路是參與癌癥發展的重要增殖調節通路。結果表明，腫瘤抑制因子LATS1的m6A修飾可能參與mRNA表達下調和細胞代謝過程的負調控。MeRIP-seq結果顯示，LATS1 mRNA的m6A修飾水平在兩個以上位點顯著上調(圖1e)。為了確定乳腺癌中LATS1中m6A修飾的機制，我們使用SRAMP預測LATS1 mRNA中的m6A位點(圖1e)。如圖1f所示， METTL3被預測為MDAMB-231乳腺癌細胞m6A修飾過程中LATS1 mRNA的結合蛋白。

2）乳腺癌組織和細胞中METTL3的表達

為了研究METTL3在乳腺癌中的表達，我們檢測了其在乳腺癌組織和配對的正常組織中的蛋白水平。如圖2a所示，METTL3在乳腺導管癌組織中高表達。對乳腺癌組織微陣列進行免疫組化(IHC)結果顯示，METTL3主要表達在癌組織的細胞質和細胞核中，少量表達在細胞膜上(圖2b)。Kaplan-Meier生存分析顯示，METTL3蛋白高表達與浸潤性導管癌和腔內乳腺癌組織不良預后顯著相關(圖2c)。此外，我們在六種不同的乳腺癌細胞類型中檢測了METTL3的蛋白水平。結果如圖2d所示。METTL3在T47D細胞中表達量最高，MCF-7細胞次之，MDA-MB-231細胞中表達量最低。

3）METTL3在體外和體內均促進乳腺癌細胞的腫瘤發生

我們通過在MCF-7和T47D細胞中敲除或過表達METTL3來檢測METTL3在乳腺腫瘤發生中的作用。缺失METTL3后，T細胞增殖和存活明顯受到抑制(圖3a-b)。Transwell實驗顯示，缺失METTL3抑制MCF-7和T47D細胞的遷移和侵襲(圖3d)。在免疫缺陷小鼠中，敲除MCF-7和T47D細胞中的METTL3可以抑制相應細胞形成腫瘤的生長，而過表達METTL3則可以顯著促進移植瘤的生長(圖3e)。基于這些數據，我們證實了METTL3在乳腺癌發生中的重要作用。

4）METTL3影響乳腺癌細胞的Hippo途徑和糖酵解

RNA-seq檢測METTL3對MCF-7細胞轉錄組表達的影響。METTL3的表達顯著增加了2845個轉錄本，減少了2044個轉錄本的表達(圖4a)。KEGG分析顯示，Hippo途徑和糖酵解與METTL3表達顯著相關(圖4b)。此外，對差異表達基因的途徑富集分析表明，METTL3與乳腺癌和Hippo途徑顯著相關(圖4c)。由于RNA-seq揭示METTL3可能與乳腺腫瘤細胞的糖酵解有關，我們對METTL3 KO MCF-7乳腺癌細胞進行了代謝組學分析。差異代謝產物KEGG分析進一步證明METTL3的表達參與了癌癥的中樞碳代謝，尤其是糖酵解和糖異生作用(圖4d)。

5）METTL3促進乳腺癌細胞的糖酵解和集落形成能力

為了了解METTL3促進乳腺癌糖酵解的機制，我們評估了METTL3對MCF-7和T47D細胞糖酵解的影響。值得注意的是，我們發現METTL3的缺失降低了乳腺癌細胞系的糖酵解活性(圖5a-b)。由于Hippo通路參與癌癥發展是眾所周知的，我們預測METTL3可能介導LATS1的m6A修飾，并進一步影響Hippo通路。通過RNA下拉實驗和western blotting，我們證實了LATS1 mRNA和METTL3之間的相互作用(圖5c)。MeRIP-qPCR結果顯示METTL3的存在直接增加了LATS1 mRNA的m6A水平(圖5d)。為了確定LATS1 mRNA與METTL3相互作用的區域，我們檢測了METTL3和LATS1 mRNA之間的相互作用。突變位點基于MeRIP-seq和SRAMP預測結果。MeRIP-qPCR結果進一步證實METTL3的調控介導了LATS1 mRNA的m6A甲基化(圖5e)。為了研究m6A調控對乳腺癌細胞增殖和酵解的影響，我們進行了集落形成實驗，結果顯示METTL3敲除后抑制LATS1可以挽救乳腺癌細胞的增殖(圖5f)。此外，海馬實驗顯示，在乳腺癌細胞中，敲低METTL3表達后，抑制LATS1表達，糖酵解上調(圖5g)。

6）YTHDF2參與m6A對LATS1 mRNA的調控

由于MeRIP-seq檢測發現LATS1 mRNA有較高的m6A修飾水平，我們的目的是確定哪些m6A閱讀器可以直接識別m6A修飾位點并調節乳腺癌細胞中LATS1的表達。LATS1 mRNA的穩定性實驗表明，缺失METTL3促進了mRNA的穩定性(圖6a)，而突變LATS1 mRNA中的m6A位點也增強了這種穩定性(圖6b)。使用RNA下拉實驗和western blotting，我們發現YTHDF2是LATS1 mRNA的m6A閱讀器(圖6c)。我們發現METTL3的表達對FTO和YTHDF2的表達沒有影響(圖6d)。而LATS1蛋白水平與YTHDF2在乳腺癌細胞中的表達呈負相關(圖6e)。為了確定YTHDF2在乳腺癌細胞中的影響，并了解其在腫瘤發生和糖酵解過程中LATS1 mRNA m6A甲基化中的作用，我們改變了YTHDF2在乳腺癌細胞中的表達(圖6e)。我們發現LATS1的m6A甲基化下調了乳腺癌細胞中LATS1的表達(圖5d, 6e)，并通過抑制其磷酸化激活YAP/TAZ(圖6f)。在誘導METTL3表達后，乳腺癌細胞核中發現了高水平的YAP/TAZ，而敲低YTHDF2的表達可以糾正細胞核中的這種偏移表達(圖6f)。海馬實驗顯示YTHDF2對乳腺癌細胞的糖酵解有積極作用(圖7a)。YTHDF2在乳腺癌細胞中的表達在體外和體內都促進了腫瘤的發生(圖7b-c)。由于YTHDF2通過讀取LATS1中的m6A甲基化使LATS1 mRNA失穩，我們預測敲低YTHDF2的表達可以促進LATS1的抑瘤作用。與這一假設相一致的是，YTHDF2的缺失抑制了腫瘤的增殖、生存和侵襲，而這種抑制腫瘤的作用通過抑制LATS1的表達得以恢復(圖7c-f)。

結論：

我們發現了LATS1 mRNA的負向調控機制，即METTL3介導LATS1 mRNA中某些位點的m6A修飾，而這種修飾被YTHDF2識別。因此，乳腺癌中LATS1的表達和Hippo通路蛋白的磷酸化被抑制，最終導致糖酵解和腫瘤的發展。

參考文獻：

Xu Y, Song M, Hong Z, Chen W, Zhang Q, Zhou J, Yang C, He Z, Yu J, Peng X, Zhu Q, Li S, Ji K, Liu M, Zuo Q. The N6-methyladenosine METTL3 regulates tumorigenesis and glycolysis by mediating m6A methylation of the tumor suppressor LATS1 in breast cancer. J ExpClin Cancer Res. 2023 Jan 7;42(1):10. doi: 10.1186/s13046-022-02581-1.