T細胞在卵巢腫瘤中的浸潤增加已被反復證明可以預測患者生存率的提高。然而，盡管有證據表明卵巢癌（ovarian cancer，OC）中存在主動免疫反應，但OC對免疫檢查點阻斷（ICB）治療的反應頻率遠低于其他癌癥類型。最近的研究強調，DNA損傷反應（DDR）的缺陷會導致基因組不穩定性和腫瘤免疫原性的增加，從而導致對ICB的反應增強。蛋白磷酸酶4（PP4）是DDR的關鍵調節因子。然而，其在抗腫瘤免疫中的潛在作用目前尚不清楚。本研究明確抑制PP4在促進炎癥信號傳導和增強免疫

細胞效應功能中的作用。這些發現為進一步研究PP4抑制劑增強OC的化學免疫治療提供了支持。本研究于2022年12月發表于期刊《J Immunother Cancer》上，IF：12.469。

技術路線：

主要研究結果：

1、PP4亞基在OC中過表達

為更好的研究理解PP4在敖正中的作用，作者利用TCGA數據庫研究PPP4C, PPP4R3A, PPP4R3B, PPP4R2亞基的基因組水平變化，發現PP4亞基基因在大約6%的OC腫瘤中主要擴增（圖1A）。類似于OC，浸潤性乳腺癌，膀胱尿路上皮癌和景園細胞劉也顯示PP4亞單位基因顯著擴增（圖1A）。此外，還觀察到信使之間有顯著的一致性和泛癌TCGA數據庫中PPP4C的RNA水平（圖1B）。為評估在OC中靶向PP4復合物的效用，作者接下來評估OC TCGA數據集中PP4亞基的表達水平。利用RNA-seq數據，發現與正常卵巢和輸卵管組織相比，PPP4C在OC中顯著過表達（圖1C），而調節亞基的表達水平是可變的。PPP4R3B和PPP4R2 mRNA表達增加。相比之下，PPP4R3A在正常組織中含量更高（圖1C）。在蛋白質水平上，PP4C被發現在代表性的高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)細胞系中穩定表達（圖1D）。作者注意到PPP4R3β調節亞基在OC細胞系中的表達變化，其中HTYK-nu和59M的表達變化最小（圖1D）。類似的結論在PPP4R3α和PPP4R2中也可以觀察到（圖1D）。總之，上述數據表明PP4C在OC中表阿達上調。

圖1 PP4亞基在卵巢癌中擴增

2、PP4C的基因沉默或藥物抑制提高OC中卡鉑的敏感性

作者使用CRISPR生成p53敲除ID8細胞系模型。在ID8-p53WT和ID8-p53KO中，用siRNA敲低PPP4C表明，PP4C表達的缺失導致這兩種細胞系對卡鉑的敏感性增加（圖2A）。WB證實轉染siRNA后PP4C的表達（圖2A）。作者通過正交試驗獲得了PP4C穩定敲除的ID8-p53 KO細胞。與siRNA結果一致，與載體對照或親代細胞相比，低PP4C表達的ID8-p53KO細胞對卡鉑處理越來越敏感（圖2B）。WB證實抗生素選擇后PP4C的表達（圖2B）。同樣，在ID8小鼠細胞系中，以納摩爾水平使用PP4的藥理抑制劑fostriecin治療也導致對卡鉑的敏感性增強（圖2C）。與卡鉑單獨處理相比，fostriecin和卡鉑聯合處理ID8-p53KO和人OC細胞系OVCAR3和OVCAR8的集結腸形成能力下降（圖2D-E）。這些發現表明抑制PP4活性可導致OC卡鉑敏感性增加。細胞熱位移實驗（CETSA）表明fostriecin處理提高PP4C蛋白的熱穩定性，這證實PP4C是fostriecin在OC細胞系中的直接靶點（圖2F）。

圖2 PP4抑制或敲除使卵巢癌細胞系對卡鉑敏感

3、抑制PP4C可增強卡鉑誘導的DNA損傷

作者發現，fostriecin聯合卡鉑抑制PP4導致多個OC細胞系微核形成增加（圖3A）。作者試圖確定fostriecin處理是否影響H2AX（S139）磷酸化（γ-H2AX），結果表明，fostriecin與卡鉑聯合治療可增加γ-H2AX病灶的數量（圖3B），γ-H2AX焦點強度，以及OC細胞整體γ-H2AX水平。由于已知卡鉑可以誘導鏈間交聯（interstrand crosslinks，ICLs），作者接下來研究是否FANCD2焦點，ICLs的關鍵傳感器，被PP4抑制改變。與文獻報道一致，作者發現卡鉑治療后FANCD2焦點增加。然而，fostriecin處理并沒有增加每個細胞中FANCD2焦點的數量（圖3B）。用RAD51抑制劑處理的細胞，B-02，作為陽性對照。通過siRNA或fostriecin處理PPP4C可以抑制DR-GFP細胞系的HR（圖3C）。這些數據表明，抑制PP4導致增加卡鉑治療后OC細胞系DNA損傷和基因組不穩定性標記。

圖3 PP4的藥理抑制增強卡鉑誘導的DNA損傷

4、PP4抑制促進OC炎癥信號通路

由于抑制PP4后觀察到的微核增加（圖3A），作者推測在PP4活性喪失的情況下，OC細胞中炎癥信號會增加。STAT1的完全轉錄激活需要額外的S727磷酸化。作者發現，與卡鉑單獨處理相比，fostriecin和卡鉑聯合處理導致OC細胞系中STAT1（Y701）磷酸化增加（圖4A）。與fostriecin治療相似，PPP4C聯合卡鉑也導致OC細胞系中STAT1激活增加（圖4B）。作者在OVCAR3和OVCAR8細胞中觀察到磷酸化p65在福司曲星和卡鉑作用下顯著上調（圖4C）。siRNA聯合卡鉑處理敲低PPP4C表達后，經典的NF-kB（p65）也被激活（圖4D）。在mRNA水平，發現卡鉑與fostriecin或PPP4C siRNA聯合處理后，IFNB1、CCL5、CXCL10和IL - 6增加（圖4E）。而且，作者還觀察到PP4C敲低后，額外的衰老相關分泌表型（SASP）相關細胞因子IL - 8、CCL2、TNF - α和CXCL9表達增加（圖4F）。總之，這些數據表明抑制PP4增強卡鉑誘導的OC細胞系中的炎癥信號。

圖4 PP4活性的缺失增強了DNA損傷誘導的炎癥信號

5、PP4在OC細胞中的抑制促進了通過STING途徑的免疫細胞遷移

將小鼠OT - I CD8 T細胞或NK - 92細胞分別置于含有小鼠或人OC條件培養基的Boyden小室中（圖5A）。當小鼠CD8 T細胞和NK - 92細胞暴露于fostriecin和卡鉑聯合處理的OC細胞的條件培養基時，表現出增強的遷移能力（圖5A）。與文獻報道的Rac信號在趨化因子誘導的細胞遷移中的作用一致，作者觀察到在Rac抑制劑存在的情況下，CD8 T和NK細胞的遷移顯著減少（圖5B）。然而，作者觀察到MEK和STAT3抑制劑的細胞類型特異性反應。STAT3抑制劑Stattic抑制CD8 T細胞遷移，但增加NK - 92細胞遷移（圖5B）。與STAT3信號類似，MEK抑制也導致CD8 T和NK細胞的不同細胞反應。有趣的是，MEK抑制劑抑制NK細胞遷移，而CD8 T細胞遷移不受影響（圖5B）。為確定c GAS - STING信號是否在觀察到的T和NK細胞遷移增加中發揮作用，作者通過實驗發現STING1敲低的OVCAR8細胞條件培養基抑制PP4后不能刺激人CD8 T細胞遷移（圖5C）。這些數據表明，在OC細胞中，PP4抑制刺激的促炎信號是通過STING激活介導的。

圖5蛋白磷酸酶4在卵巢癌細胞中的下調增強了效應免疫細胞的遷移

6、在腫瘤細胞中敲低PP4C增強NK細胞的活化和對OC的細胞毒性

作者發現，與對照組相比，PPP4C或PPP4R3B敲低后IFN - γ ⁺ NK細胞顯著增加，而卡鉑進一步增加了IFN - γ ⁺ NK細胞（圖6A-B）。作者接下來評估NK - 92細胞與轉染對照、PPP4C或PPP4R3B siRNA的OVCAR8細胞共培養3小時后NK細胞脫顆粒情況，發現CD107a ⁺ NK - 92細胞對PPP4C或PPP4R3B的敲低反應顯著增加。作者還觀察到與卡鉑處理的細胞共培養時CD107a ⁺ NK - 92細胞群顯著增加（圖6C）。為進一步確定PP4缺失介導的NK細胞活化和脫顆粒的增加是否有助于NK細胞介導的OC細胞殺傷的增加，作者將轉染對照、PPP4C或PPP4R3B siRNA的OC細胞系與NK - 92細胞共培養。作者的結果表明，在OC中PPP4C或PPP4R3B的表達缺失增強NK細胞介導的OC細胞殺傷（圖6D）。卡鉑處理導致OVCAR8細胞的殺傷顯著增加，在PP4C和PPP4R3β敲低的細胞中進一步增加（圖6D）。因此，PP4的缺失促進NK細胞活化和NK細胞定向的卵巢癌殺傷。

圖6PP4的缺失促進NK細胞活化和NK細胞定向的卵巢癌殺傷

7、在一個同基因的、具有免疫功能的OC小鼠模型中，敲低PP4C會導致腫瘤生長減少和效應免疫細胞浸潤增加

接下來，作者試圖評估PP4C敲低對OC腫瘤生長的影響。研究構建了PP4C表達降低的ID8 - p53KO細胞（圖2B）。在體內，PP4C敲低導致整體腫瘤生長顯著降低（圖7A-B）。此外，與對照組相比，PP4C敲低的腫瘤中腹水形成顯著減少（圖7C）。接下來，作者測定了腫瘤、脾臟、腹腔淋巴結和腹水中的細胞變化，觀察到，與對照組相比，PP4C shRNA腫瘤中NK細胞( CD3^-CD161 ⁺ )和NK T細胞( CD3 ⁺ CD161 ⁺ )浸潤均顯著增加（圖7D-I），而卡鉑治療后沒有額外增加（圖7D-E）。與浸潤增加一致，作者在PP4C shRNA腫瘤中也發現IFN - γ⁺ NK細胞( CD3^-CD161 ⁺ )增加（圖7F）。此外，作者觀察到PP4C shRNA腫瘤內CD4 ⁺ T細胞數量顯著增加，且不受卡鉑處理的影響（圖7G）。有趣的是，在PP4C shRNA腫瘤中，卡鉑治療顯著增加了腫瘤內CD8 ⁺ T細胞的數量，而在對照組中沒有觀察到（圖7H）。此外，作者發現作為調節性T細胞代表的CD4 ⁺ CD25 ⁺ T細胞群在所有組別中保持不變（圖7I）。這些數據表明抑制PP4C降低腫瘤負擔，增強免疫效應細胞腫瘤浸潤。

圖7抑制PP4C增強免疫細胞浸潤

結論：

綜上所述，本研究突出了PP4在抗腫瘤免疫中的作用以及需要特異性抑制劑進行有效的臨床轉譯。據作者所知，這是第一份證明在癌細胞中敲除或抑制PP4會增強免疫效應細胞的遷移、功能和腫瘤浸潤的報告。根據這些發現，作者認為PP4是OC中一個有吸引力的治療靶點，值得進一步研究。

圖8 PP4C參與抗免疫抑制的機制圖

參考文獻：

Raja R, Wu C, Bassoy EY, Rubino TE Jr, Utagawa EC, Magtibay PM, Butler KA, Curtis M. (2022) PP4 inhibition sensitizes ovarian cancer to NK cell-mediated cytotoxicity via STAT1 activation and inflammatory signaling. J Immunother Cancer. 10(12):e005026. doi: 10.1136/jitc-2022-005026. PMID: 36564125