奧沙利鉑是結(jié)直腸癌（CRC）手術(shù)后常用的化療方案。然而，獲得性耐藥嚴(yán)重影響CRC患者的療效，其機(jī)制尚不清楚。本文鑒定circRNA circATG4B在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中起重要作用。并發(fā)現(xiàn)circATG4B通過(guò)促進(jìn)自噬誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。此外，circATG4B的作用歸因于其編碼一種新型蛋白質(zhì)circATG4B-222aa的潛力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circATG4B-222aa作為誘餌，和TMED10競(jìng)爭(zhēng)與ATG4B的相互作用，導(dǎo)致自噬增加，隨后誘導(dǎo)耐藥。因此，本研究揭示外泌體circATG4B參與CRC細(xì)胞化療敏感性的降低，為CRC奧沙利鉑耐藥的潛在治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。本研究于2022年12月9日發(fā)表于《AdvSci (Weinh)》，IF：17.521

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、ATG4B相關(guān)circRNA在奧沙利鉑耐藥中的分析

越來(lái)越多的證據(jù)證明circRNA參與宿主基因的功能。基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)circBase，作者評(píng)估15種源于ATG4B的circRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0 007159 （circATG4B）在奧沙利鉑耐藥患者CRC組織中顯著上調(diào)（圖1A），與細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)一致（圖1B）。以cDNA和基因組DNA（gDNA）為模板，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，結(jié)果表明，擴(kuò)增的cDNA中只有預(yù)期大小的產(chǎn)物，而gDNA中沒(méi)有（圖1C）。此外，Sanger測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的circATG4B頭尾剪接，提示circATG4B來(lái)源于ATG4B基因的外顯子，這與circBase中circATG4B數(shù)據(jù)是一致的（圖1D）。與線性形式相比，circATG4B具有較長(zhǎng)的半衰期，并對(duì)RnaseR處理具有抗性（圖1E-F），進(jìn)一步說(shuō)明circATG4B確實(shí)以環(huán)狀形式存在。FISH結(jié)果顯示circATG4B主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在耐奧沙利鉑CRC細(xì)胞中比敏感細(xì)胞中含量高的多（圖1G）。接著，作者評(píng)估幾種奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系和匹配的CRC細(xì)胞中的circATG4B水平。與這些結(jié)果一致的是，circATG4B在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系顯著高表達(dá)（圖1H）。Kaplan - Meier生存分析顯示，在circATG4B低表達(dá)的患者中，接受奧沙利鉑治療的患者無(wú)病生存期（DFS）顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（圖1I）。相反，在circATG4B水平較高的患者中，奧沙利鉑治療組與對(duì)照組的DFS時(shí)間無(wú)差異（圖1J）。此外，作者發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑治療僅在circATG4B低表達(dá)的患者中是獨(dú)立的預(yù)后因素，而在circATG4B高表達(dá)的患者中則不是（表1）。此外，在接受奧沙利鉑治療的隊(duì)列中，與circATG4B低表達(dá)的患者相比，circATG4B高表達(dá)的患者有更差的DFS（圖1K）。這些結(jié)果表明circATG4B與CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的反應(yīng)密切相關(guān)。

圖1 circATG4B在奧沙利鉑相關(guān)CRC細(xì)胞過(guò)表達(dá)

表1

2、外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

作者猜想circATG4B可能從奧沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到奧沙利鉑敏感細(xì)胞。為證明這個(gè)猜想，作者從耐奧沙利鉑CRC細(xì)胞上清中分離出外泌體，經(jīng)電鏡鑒定為典型的具有雙層膜的圓形顆粒（圖2A）。NTA（納米顆粒追蹤分析）發(fā)現(xiàn)顆粒大小（圖2B）。圖2C展示外泌體外泌體因子CD45，CD9和Annexin的表達(dá)。qRT-PCR顯示，circATG4B在奧沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞系中明顯上調(diào)，尤其是在HCT116-L-OHP和SW480-L-OHP細(xì)胞系衍生的外泌體中上調(diào)（圖2D），與細(xì)胞表達(dá)水平一致。當(dāng)CRC細(xì)胞與來(lái)自?shī)W沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞的外泌體（PKH26標(biāo)記）共培養(yǎng)時(shí)，在受體細(xì)胞中觀察到大量外泌體（紅色），表明CRC細(xì)胞具有較高的外泌體攝取效率（圖2E）。在與分離的外泌體或PBS在母本細(xì)胞中孵育后，作者發(fā)現(xiàn)circATG4B由于與用si-NC或不使用si-NC處理的奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)而顯著上調(diào)，當(dāng)外泌體的circATG4B被siRNA擊殺后，這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)（圖2F）。

假定外泌體circATG4B來(lái)源于奧沙利鉑耐藥細(xì)胞，作者進(jìn)一步研究其對(duì)化療耐藥的影響。作者的結(jié)果展示與exo-si-NC相比，共孵育exo-si-circATG4B增加CRC細(xì)胞中奧沙利鉑對(duì)小鼠細(xì)胞凋亡的抑制率和誘導(dǎo)率（圖2G-H）。為探索體內(nèi)外泌體circATG4B的作用，采用皮下注射HCT116細(xì)胞建立小鼠異種移植模型。每4天測(cè)量一次腫瘤的大小，16天后處死所有的小鼠（圖2I）。exo-si- NC處理的腫瘤的生長(zhǎng)率和腫瘤重量均高于外源性exo-si-circATG4B或PBS處理的腫瘤（圖2J-L）。這表明CRC中外泌體circATG4B對(duì)奧沙利鉑的敏感性降低。以上結(jié)果說(shuō)明外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。

圖2外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

3、外泌體CircATG4B提高奧沙利鉑抗藥過(guò)程的活性

自噬在化療耐藥中起著重要的作用，因此作者測(cè)量抗奧沙利鉑細(xì)胞和親代細(xì)胞的自噬水平。值得注意的是，在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞中觀察到LC3B-II/I的比例高于相應(yīng)的親本細(xì)胞（圖3）。為確定自噬是否對(duì)奧沙利鉑耐藥至關(guān)重要，作者用雷帕霉素（RAPA，自噬誘導(dǎo)物）處理CRC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RAPA治療誘發(fā)藥物耐藥（圖3B）。相反，作者發(fā)現(xiàn)3-MA（甲基腺嘌呤），一種常見(jiàn)的自噬抑制劑，增加耐藥CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性（圖3C），進(jìn)一步表明自噬在奧沙利鉑耐藥中起重要作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)用外對(duì)照處理的CRC細(xì)胞比用PBS處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的耐藥性，并且這種化學(xué)耐藥性在用PBS處理后大大逆轉(zhuǎn)（圖3D），表明外泌體可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬，促進(jìn)從藥物敏感到耐藥的轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)染circATG4B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的CRC細(xì)胞化療耐藥性增加。然而，3-MA處理逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)(圖3E )，表明circATG4B可以通過(guò)自噬誘導(dǎo)化療耐藥。此外，作者探究外泌體circATG4B在自噬過(guò)程中的作用。用奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞分泌的多種外泌體處理后，在受體細(xì)胞系HCT116和SW480中進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。免疫熒光（IF）染色結(jié)果顯示，exo-si-NC預(yù)處理的CRC細(xì)胞中自噬小體形成顯著增加，而circATG4B水平降低的外泌體預(yù)處理的CRC細(xì)胞中綠色斑點(diǎn)數(shù)量減少（圖3F）。此外，TEM分析顯示，exo-si-NC預(yù)處理后自噬體數(shù)量增加，而exo-sio-circATG4B預(yù)處理后自噬體數(shù)量明顯減少（圖3G）。此外，與PBS處理相比，轉(zhuǎn)染si - NC的奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的外泌體處理顯著促進(jìn)LC3B - I到II的轉(zhuǎn)化，而當(dāng)外泌體circATG4B被敲低時(shí)，LC3B - II積累被抑制（圖3H）。此外，在前期建立的異種移植小鼠模型中IHC結(jié)果顯示，與exo-si-NC組相比，exo-si-circATG4B處理的CRC細(xì)胞中p62的表達(dá)水平顯著升高，LC3B和Ki67（細(xì)胞增殖的標(biāo)志物）的表達(dá)水平降低（圖3I），進(jìn)一步證實(shí)外泌體circATG4B通過(guò)調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。

圖3外泌體circATG4B促進(jìn)自噬水平

4、CircATG4B編碼一種新的222氨基酸（aa）蛋白，CircATG4B-222a

RIP結(jié)果顯示circATG4B與AGO2不相關(guān)（圖4A），提示circATG4B可能通過(guò)不同的機(jī)制行使其功能。查閱circ RNA Db中的注釋，作者發(fā)現(xiàn)circATG4B有一個(gè)669 nt的開(kāi)放閱讀框（ORF），具有編碼222個(gè)氨基酸蛋白的潛力（圖4B）。在circATG4B的ORF中，circRNA序列中串聯(lián)的' AUG '密碼子可以啟動(dòng)新蛋白的翻譯，而終止密碼子' UAG '可以終止翻譯。包含有33個(gè)特異性氨基酸的新序列命名為' circATG4B-222aa '（圖4C）。

由于circRNA沒(méi)有5′- cap序列，可以啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯，因此需要一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）。作者在ORF中發(fā)現(xiàn)一個(gè)IRES，并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circATG4B中IRES的活性（圖4D-E）。為確認(rèn)circATG4B - 222aa的存在，研究構(gòu)建4個(gè)帶有不同flag標(biāo)簽的載體，并將其克隆到CMV誘導(dǎo)表達(dá)載體中（圖4F）。在轉(zhuǎn)染circATG4B - flag載體或circATG4B - flag - mut載體的CRC細(xì)胞中，circATG4B的表達(dá)明顯上調(diào)。與轉(zhuǎn)染空載體相比，轉(zhuǎn)染circATG4B - 222aa載體并未明顯改變circATG4B的表達(dá)（圖4G）。這4種載體均不影響線性ATG4B mRNA水平。此外，ATG4B的表達(dá)不受4種載體的影響（圖4H）。最后，通過(guò)SDS - PAGE分離轉(zhuǎn)染circATG4B和空載體的HEK - 293T細(xì)胞總蛋白，切取大小約為24 kD的蛋白條帶進(jìn)行LC - MS / MS分析，成功鑒定出circATG4B剪接連接處形成的獨(dú)特肽段序列，表明circATG4B能夠編碼一種新的蛋白（圖4I）。此外，circATG4B - 222aa在化療耐藥的CRC細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高（圖4J）。將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞后，使用抗鞭毛抗體進(jìn)行免疫熒光染色以鑒定circATG4B-222aa的細(xì)胞質(zhì)定位（圖4K）。最后，circATG4B - 222aa表達(dá)與接受奧沙利鉑治療的CRC患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，表明circATG4B - 222aa可能是奧沙利鉑耐藥的預(yù)后標(biāo)志物（圖4L）。

圖4 circATG4B編碼能力的評(píng)價(jià)

5、CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內(nèi)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

為探究circATG4B - 222aa的生物學(xué)功能，將上述4種帶不同flag標(biāo)簽的載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染circATG4B或circATG4B - 222aa過(guò)表達(dá)載體后，LC3B的點(diǎn)狀聚集數(shù)量、自噬體形成和LC3B - I / II的轉(zhuǎn)換均顯著增加（圖5A-C）。而轉(zhuǎn)染circATG4B - mut載體的CRC細(xì)胞無(wú)明顯變化，推測(cè)其無(wú)法啟動(dòng)circATG4B - 222aa的翻譯。這些結(jié)果表明，僅過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa可增加自噬水平。有趣的是，過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa降低奧沙利鉑敏感性和奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而過(guò)表達(dá)突變體circATG4B對(duì)這些現(xiàn)象無(wú)明顯影響（圖5D-E）。為進(jìn)一步探討circATG4B - 222aa在體內(nèi)的作用，通過(guò)皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同circATG4B載體的HCT116細(xì)胞建立異種移植小鼠模型。每4 d測(cè)量一次腫瘤的大小，circATG4B和circATG4B - 222aa組的生長(zhǎng)速度和腫瘤重量均大于vector對(duì)照組和circATG4B - mut組（圖5F-H）。檢測(cè)裸鼠移植瘤中LC3B、p62和Ki67的表達(dá)。IHC結(jié)果顯示，與對(duì)照組和circATG4B - mut組相比，circATG4B和circATG4B - 222aa組中LC3B和Ki67的表達(dá)水平顯著升高，p62的表達(dá)水平顯著降低（圖5I）。總之，這些結(jié)果表明circATG4B-222aa而不是circATG4B增加CRC細(xì)胞的自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。

圖5 CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內(nèi)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

6、CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED10介導(dǎo)的抑制

為探索circATG4B - 222aa在自噬中的潛在作用機(jī)制，將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK - 293T細(xì)胞中，免疫共沉淀和質(zhì)譜分析檢測(cè)circATG4B - 222aa潛在的相互作用蛋白。作者對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定（圖6A），發(fā)現(xiàn)在識(shí)別蛋白的排序列表中豐度最高的蛋白為T(mén)MED10（圖6B）。因此，推測(cè)TMED10是circATG4B - 222aa的潛在靶點(diǎn)。此外，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)circATG4B - 222aa在CRC細(xì)胞中確實(shí)與TMED10存在相互作用（圖6C）。在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶有flag標(biāo)簽的circATG4B - 222aa，免疫熒光染色也表明circATG4B - 222aa與TMED10存在共定位（圖6D）。

為探究TMED10與circATG4B - 222aa相互作用的結(jié)構(gòu)域，作者構(gòu)建一系列帶有GFP標(biāo)簽的TMED10缺失突變體（圖6E）。TMED10的LD - only突變體與circATG4B - 222aa不結(jié)合，表明TMED10的TD和CD都是TMED10與circATG4B - 222aa相互作用所必需的（圖6F）。通過(guò)對(duì)circATG4B - 222aa的帶有flag標(biāo)簽的截短突變體進(jìn)行Co - IP分析，作者也鑒定circATG4B - 222aa參與TMED10 - circATG4B - 222aa相互作用的區(qū)域（圖6G）。circATG4B-222aa ( aa1 - 111)和circATG4B - 222aa ( aa112 ~ 222)的截短體均可被TMED10拉下（圖6H），表明全長(zhǎng)circATG4B - 222aa與TMED10存在相互作用。

在進(jìn)一步的研究中，作者發(fā)現(xiàn)circATG4B - 222aa的表達(dá)增加LC3B - I / II的轉(zhuǎn)換，但兩個(gè)截短突變體均不能（圖6I），表明全長(zhǎng)circATG4B - 222aa負(fù)責(zé)自噬過(guò)程。Co - IP結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa削弱TMED10與ATG4B的相互作用（圖6J），表明circATG4B - 222aa導(dǎo)致ATG4B與TMED10解離。作者進(jìn)一步在CRC細(xì)胞中驗(yàn)證TMED10與circATG4B - 222aa的相互作用。在CRC細(xì)胞中，增加circATG4B - 222aa水平通過(guò)激活A(yù)TG4B增強(qiáng)GLUC連接的LC3的切割（圖6K）。這些結(jié)果表明circATG4B - 222aa可能作為T(mén)MED10的誘餌，逃避TMED10誘導(dǎo)的ATG4B抑制。

圖6 CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED 10介導(dǎo)的抑制

7、在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中，CircATG4B – 222aa逆轉(zhuǎn)TMED10誘導(dǎo)的化療敏感性

隨后，作者評(píng)估circATG4B - 222aa與TMED10的相互作用在奧沙利鉑耐藥中的功能。circATG4B - 222aa逆轉(zhuǎn)TMED10誘導(dǎo)的CRC耐藥細(xì)胞凋亡和化療敏感性的增加（圖7A-B）。為進(jìn)一步研究circATG4B - 222aa與TMED10在體內(nèi)的功能聯(lián)系，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤小鼠于第16天給予奧沙利鉑治療。過(guò)表達(dá)TMED10細(xì)胞組的腫瘤生長(zhǎng)和重量均顯著下降，而過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa逆轉(zhuǎn)這種抑癌作用（圖7C-E）。這些結(jié)果表明circATG4B - 222aa可以通過(guò)與TMED10相互作用并增加自噬活性來(lái)誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥（圖7F）。

圖7在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中，Circatg4B - 222Aa逆轉(zhuǎn)Tmed10誘導(dǎo)的化療敏感性

結(jié)論:

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞來(lái)源的上調(diào)的外泌體circATG4B可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，從而在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。此外，circATG4B編碼一個(gè)新的功能蛋白（circATG4B-222aa）。circATG4B-222aa在體內(nèi)外均可促進(jìn)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥，但circATG4B本身并不促進(jìn)自噬。此外，circATG4B - 222aa與TMED10存在競(jìng)爭(zhēng)性相互作用，并作為誘餌阻止TMED10與ATG4B結(jié)合，導(dǎo)致自噬增加并誘導(dǎo)耐藥。總之，本研究證明circRNA在CRC耐藥獲得中的新機(jī)制。新型circATG4B - 222aa是重要的生物標(biāo)志物，可能作為奧沙利鉑耐藥CRC的潛在治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Pan Z, Zheng J, Zhang J, Lin J, Lai J, Lyu Z, et al. (2022) A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy. AdvSci (Weinh);9(35):e2204513. doi: 10.1002/advs.202204513.