近年來，轉錄組和代謝組的聯合分析得到了廣泛的應用，成為鑒定許多與生物表型性狀相關的關鍵基因和代謝物的有力工具。為此，有研究通過整合代謝組和轉錄組分析，研究了5個不同顏色茄子品種的特征性代謝組分和候選調控基因。通過加權基因共表達網絡分析(WGCNA)得到類黃酮合成的調控網絡和一些新的關鍵基因。這一發現不僅對類黃酮合成的分子網絡提供了新的見解，而且為未來茄子的分子育種提供了有價值的信息。該研究2022年11月發表在《international Journal of Molecular Sciences》，IF：6.2。

技術路線：

主要研究結果：

1. 果皮顏色與總花青素和葉綠素含量的變化

研究中使用的5個品種：A1和A3的果皮為黑紫色，但花萼顏色不同，A2的果皮為綠色，A4的果皮為白色，A5的果皮為紅紫色(圖1A)。A1(黑紫)、A2(綠色)、A3(黑紫)、A4(白色)、A5(紅紫)的明度值(L*)分別為24.21、53.75、24.61、89.47、33.05。黑紫色品種A1和A3的明度值最低。也就是說，A1和A3的果皮顏色比其他品種更深。紅度值(a*)在?20.54 ~ 27.23之間，其中A5紅度值最高，果皮呈紅紫色。黃度參數(b*)范圍為?8.55 ~ 37.88，其中果皮為綠色的A2黃度值最高(圖1B)。測定了5個品種的總花青素和葉綠素含量。花青素總含量以A1最高，其次是A3和A5，而A2和A4的花青素總含量顯著較低(圖1C)。A2的葉綠素總含量略高于A1和A3。在A4和A5中檢測到的總葉綠素量非常低(圖1D)。總花青素和葉綠素含量均以A4最低。總體上，果皮顏色值和色素含量與果皮顏色變化趨勢一致。

圖1 5個不同果色茄子品種的表型

2. 類黃酮代謝差異

基于LC-MS/MS對彩色茄子果實中的黃酮類化合物進行了廣泛的靶向代謝物分析。共鑒定出260種黃酮類代謝物，包括花青素32種、查爾酮10種、黃烷醇5種、黃酮25種、黃烷醇11種、黃酮58種、黃酮碳苷11種、黃酮醇86種、異黃酮10種、原花青素A6和單寧11種。層次聚類分析(HCA)展示五個茄子品種的相對含量的表型變異(圖2A)。共鑒定出32種花青素，其中飛燕草苷10種、矢車菊苷14種、牽牛花苷3種、馬爾維甲苷2種、杜鵑花苷2種、天竺葵苷1種。5個茄子品種中鑒定出的花青素的相對含量差異很大(圖2B)。在綠色和白色果皮的A2和A4中均未檢測到飛燕草苷、牽牛花苷和馬爾維定苷。在紅色至深紫色組(A1、A3和A5)已鑒定的花青素中，A1和A5中含量最高的是D3R、del-3-O-(2-O-p-coumaroyl)rutinoside-7-O-glu和del-3-O-(2-O-p-coumaroyl)rutinoside-5-O-glu (nasunin)。有趣的是，D3R和nasunin是紫茄子中最具代表性的花青素化合物，在A3中沒有檢測到，而del-3-O-(6-O-p-coumaroyl)glu和cya-3-O-(6-O-p-coumaroyl)glu的含量在A3中最高。總體上，已鑒定的花青素在A1中含量最高，其次是A3和A5。在本研究中，5個品種之間的黃酮類代謝產物存在顯著差異。檢測到以鼠李糖、半乳糖、蘆丁糖和葡萄糖為主要糖配體的各種類黃酮苷。其中，山奈酚、槲皮素、楊梅素、木犀草素及其衍生物是茄子中主要的黃酮醇和黃酮。黃酮類化合物在A4中積累最多，含量最低，其次是A2。在紅-黑-紫組(A1、A3和A5)中，A1和A5的類黃酮積累模式與A3更為相似。通常情況下，大多數查爾酮，單寧和黃酮醇在A3中的含量高于A1和A5。主成分分析來說明5個品種中多個變量的內部結構(圖3)。在PCA圖中，質量控制(QC)樣本被分組在一起，表明分析的穩定性和重復性。與HCA結果一致，A1和A5在圖中距離較近，表明其代謝積累模式相似。雖然A1和A5聚在一起較近，但5個品種可以很容易區分。

圖2 不同顏色茄子果實的代謝組學分析

3. 5個茄子品種代謝產物積累差異的比較

建立正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)評分圖，分析5個品種的兩兩差異。高可預測性以及5個品種間兩兩比較OPLS-DA模型的擬合優度(R2X和R2Y)較強(圖4)，說明代謝數據的可靠性。雖然在PCA圖中A1和A5相互靠近，但在OPLS-DA模型中，A1、A2、A3、A4和A5明顯分開，表明不同果皮顏色組之間的黃酮類化合物代謝譜存在主要差異。采用差異倍數≥2或≤0.5和VIP (variable importance in project)≥1的標準進行兩兩比較，進一步確定差異累積的代謝物(dam)。與果皮顏色為白色的A4相比，A1(黑紫色)、A2(綠色)、A3(黑紫色)、A5(紅紫色)分別鑒定出156、101、145、150只母鼠(圖5A)。正如預期的那樣，隨著果皮顏色從白色變成黑紫色，其他4個品種的大多數水壩都上調了。在A4 vs. A1、A4 vs. A2、A4 vs. A3和A4 vs. A5比較組中，共觀察到48只母鼠(圖5B)。在紅色到黑紫色組(A1 vs A3, A1 vs A5, A3 vs A5)中，A1 vs A5的dam數量最少(A5中上調46個，下調32個)。與A3相比，A1和A5分別觀察到146個dam(105個下調和41個上調)和143個dam(99個下調和44個上調)(圖5A)。大多數的水壩，包括查爾酮，黃烷醇，黃酮醇和單寧，在A3上調。

將5個品種之間的差異代謝產物映射到KEGG數據庫中，并對每個對照組的dam進行KEGG富集分析。所有對照組中檢測到的最豐富的途徑是類黃酮生物合成、花青素生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、異類黃酮生物合成和次生代謝產物生物合成。

圖3 5個茄子品種類黃酮譜的PCA評分圖

圖4 比較組的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型

圖5 5個茄子品種的類黃酮差異分析

4.五個茄子品種果皮的比較轉錄組

5個品種共建立15個文庫，每個品種3個生物重復。去除適配器和低質量序列后，每個品種共獲得20.66~21.4 Gb的清潔讀長。每個文庫的Q20和Q30值分別等于或大于97.43和92.92%(表1)。這些干凈的reads被映射到參考基因組，匹配率在96.64~ 97.91%。以log2比值表達變化倍數≥1且錯誤發現率≤0.01為閾值鑒定差異表達基因(DEGs)，在所有樣本中共獲得10110個DEGs。比較組分別有4265、3987、4005、4253、3837、3629、4456、4095、2881和2152個DEGs，包括A1 vs. A2、A1 vs. A3、A1 vs. A5、A2 vs. A5、A3 vs. A5、A4 vs. A1、A4 vs. A2、A4 vs. A3、A4 vs. A5(表2)。在這些比較組中，A4 vs. A5組的上調和下調DEGs數量最少。對這些DEGs進行GO富集分析顯示，與“細胞”、“細胞部分”和“細胞器”相關的基因在細胞成分類別中占主導地位。在分子功能類別中，富集最多的項是結合和催化活性。在生物過程類別中，基因主要參與代謝和細胞過程。KEGG注釋結果顯示，所有樣本的DEGs共映射到141條KEGG通路，其中次級代謝物生物合成、植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成、花青素生物合成、光合作用、光合-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝等KEGG通路顯著富集。

5. 參與類黃酮生物合成的DEGs的鑒定

為了探索不同果皮顏色茄子中黃酮類物質的積累機制，分析了苯丙素和黃酮類物質通路中涉及的基因表達模式。正如預期的那樣，大部分參與類黃酮生物合成的結構基因，包括PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT，在A2和A4中轉錄水平顯著較低，這可能是A2和A4中類黃酮水平較低的原因之一(圖6)。F3。wH在A2和A4中沒有或非常弱的表達水平，這表明F3thaH可能是直接決定茄子果皮紫色的關鍵因素。

在A1與A3、A1與A5、A3與A5比較組中，類黃酮生物合成途徑相關的結構基因也存在差異表達。在A1與A5和A3與A5的比較中，A5的早期和晚期生物合成基因均下調，包括PAL、4CL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3 3HH、DFR、ANS和UFGT。值得注意的是，在A1和A3的比較中，早期生物合成基因包括CHS、CHI、F3H和F3nd H沒有差異表達，大部分DEGs是晚期生物合成基因，如DFR、ANS和花青素修飾基因(Smechr0502047、Smechr0400421和Smechr1102789)。

總體而言，在黑紫色果皮的A1和A3中，大部分參與類黃酮生物合成的結構基因均高表達。隨著紫色的降低，A5中黃酮基因表達量下降，A2和A4表達量最低。

圖6 花青素/類黃酮通路相關基因的表達譜

6. 參與葉綠素代謝的DEGs的鑒定

茄子果皮的綠色主要受葉綠素的影響。在這項研究中,共計27度與葉綠素代謝被確定(圖7)。A2綠色水果皮相比,大多數的度顯示低表達在A4和A5, (Smechr0402030和Smechr0100518),包括宋春芳HEMC (Smechr0702754)、血紅素(Smechr0400257和Smechr0601135), HEMF (Smechr0400064) HEMG (Smechr0102139) CHLH (Smechr0400430) CHLM (Smechr0303264), CRD (Smechr1002947)、運動(Smechr0702049), DVR (Smechr0100030),曹(Smechr0601739和Smechr1200635),NOL (Smechr0701042)和HCAR (Smechr0902459)。

圖7 葉綠素代謝途徑相關基因的差異表達

7. 參與激素介導信號通路的DEGs的鑒定

KEGG富集分析顯示，植物激素信號轉導通路是富集最顯著的通路之一。在生長素信號通路中，5個DEGs的表達水平與顏色變化相關，包括AUX/IAA (Smechr0303465)、ARF (Smechr0101326)、GH3 (Smechr0400187)和SAUR (Smechr0100144和Smechr1100127)。在赤霉素信號通路中，GID1 (Smechr1000150)和DELLA (Smechr0500162和Smechr0500354)的表達與果皮顏色變化呈正相關。與乙烯信號通路相關的基因ETR (Smechr0902323)和EBF1/2 (Smechr0700262和Smechr1200241)以及與BR信號通路相關的基因BRI1 (Smechr0702406)和BKI1 (Smechr0502339)的表達與5個品種的顏色變異相關。ABA信號通路中的ABF (Smechr0100651)和SnRK2 (Smechr0401004和Smechr0802058)在黑紫色果皮的A1和A3中表達量較高。同時，SA信號通路中TGA (Smechr1002700)的表達與5個品種的顏色變異具有相關性。具體而言，參與JA信號通路的兩個bHLH轉錄因子在5個品種中表達水平不同，其中SmTT8 (Smechr0901701)也參與類黃酮的生物合成(補充圖S2)。

8. 共表達基因網絡和關鍵候選基因的鑒定

為了研究茄子果實果皮著色的基因調控網絡，使用6241個非冗余DEGs進行加權基因共表達網絡分析(WGCNA)，得到了20個不同顏色標記的模塊(圖8)。以總花青素含量和總葉綠素含量以及飛葵素型花青素作為表型數據進行分析。分析表明，紫模塊和紫模塊分別與花青素含量和葉綠素含量呈正相關(圖9A)。分組到不同模塊的基因KEGG富集分析顯示，紫色模塊的基因富集于類黃酮生物合成，而紫色模塊的基因富集于光合-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝。在紫色模塊的關聯網絡中，四個轉錄因子SmGL2 (Smechr0303487)、SmGATA26 (Smechr0601814)、SmWRKY44 (Smechr1002420)和SmTT8 (Smechr0901701)以及連接度最高的類黃酮生物合成通路相關基因SmF3mFtH (Smechr1201797)、SmUFGT (Smechr1002540)、SmPAL (Smechr0500713)和Sm4CL (Smechr0302347)被確定為樞紐基因(表3，圖9B)。SmWRKY44和SmTT8已被報道參與花青素的生物合成。因此，為了進一步研究SmGL2和SmGATA26的功能，構建TRV2-SmGL2, TRV2-SmGATA26和TRV2-SmWRKY44重組體來沉默茄子紫色皮中的SmGL2, SmGATA26和SmWRKY44。與TRV2相比，沉默SmGL2、SmGATA26和smwrky44的茄子果皮中的花青素積累減少，表明SmGL2和SmGATA26可能參與花青素的生物合成(圖9C)。

圖8 層次聚類呈現20個共表達基因的模塊

圖9花青素合成相關基因網絡及關鍵候選基因的鑒定

9. 實時熒光定量PCR對差異表達基因的驗證

為驗證RNA-Seq數據的準確性，選取16個差異表達基因(包括8個hub基因)進行實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析。如圖10所示，qRT-PCR結果顯示這些基因的表達模式與RNA-seq結果一致，說明轉錄組測序結果可靠。

圖10 5個茄子品種中16種DEGs的實時熒光定量PCR分析