胃癌（GC）是癌癥相關死亡的第三大常見原因。盡管GC的治療已得到極大改善，但由于無法在早期診斷該癌癥，生存率仍然很低。約1/3的GC患者被診斷為晚期轉移，4-14%的患者有肝臟轉移性疾病。由于GC轉移通常以多發性和彌漫性分布為特征，絕大多數患者此時已失去手術治療的機會。因此，迫切需要解開腫瘤轉移的分子機制。越來越多的證據表明，SNAI2通過轉錄調節下游靶基因在驅動腫瘤轉移中起關鍵作用，揭示SNAI家族的靶基因對于更好地了解腫瘤轉移至關重要。ELF3-AS1是一種細胞周期相關的lncRNA，據報道lncRNA ELF3-AS1在肺癌中作為癌基因起作用。然而，ELF3-AS1在GC中的生物學功能尚不清楚。該研究發表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技術路線：

主要研究結果：

1. GC中轉錄阻遏因子SNAI2調控lncRNA的探索

為了探索SNAI2的靶基因，RNA測序研究（GSE161551）在過表達SNAI2的GC細胞系（SGC7901）中進行。共有318個編碼基因，其中70個lncRNA被SNAI2強烈抑制，55個編碼基因和53個lncRNA被SNAI2大幅上調。如圖1A所示，IGFBP1/3、ITGB4、CLDN1/4、TJP3、EFNA1、KRT80、ELF3等的表達受到SNAI2的強烈抑制，而CYR61、CTGF、IL11、ID2/3、RBM3、THBS1等的表達受到SNAI2的強烈上調。類似地，大約123個lncRNA，包括linc01315，MIR210HG，FZD10-DT，linc00963，HOXB-AS3，LUCAT1，ITPR1-DT，PDCD4-AS1，ZNF197-AS1等，在過表達SNAI2后極大地改變了它們的表達。有趣的是，反義lncRNA ELF3-AS1及其鄰近基因ELF3都被SNAI2強烈抑制（圖1B)。

為了進一步確認ELF3-AS1和ELF3是否可能受到SNAI2的負調節，在兩個GC細胞系中進行了關于SNAI2的功能喪失和功能獲得研究。正如預期的那樣，ELF3-AS1和ELF3在SNAI2過表達細胞系中顯著下調，但在SNAI2去除細胞系中顯著上調（圖1C-E）。這些結果表明，在GC中，SNAI2對ELF3-AS1和ELF3均呈負調控。

ELF3-AS1是上皮腫瘤抑制基因ELF3的反義lncRNA。啟動子分析顯示，ELF3-AS1啟動子含有一個序列“GGTACAGGTGGGT”，預測被SNAI2和SNAI1識別。該序列位于ELF3-AS1轉錄起點上游829 bp，這也是ELF3基因外顯子2和內含子2之間的連接點（圖1F）。因此，作者推測ELF3-AS1和ELF3可能受到SNAI2和SNAI1的轉錄調控。

圖1 通過RNA-seq鑒定GC中SNAI2調控的lncRNA

2. ELF3-AS1和ELF3被SNAI2和SNAI1轉錄抑制

LncRNA ELF3-AS1在人體細胞中含量豐富，在RNA測序時可被磁珠有效捕獲。為了使作者的結果更具說服力，作者使用RNA-seq研究來可視化ELF3-AS1和ELF3的表達。正如預期的那樣，RNA-seq分析和qRT-PCR測定共同表明ELF3-AS1和ELF3被SNAI2 / SNAI1過表達下調（圖2A-F）。此外，SNAI2對ELF3和ELF3-AS1表達的抑制強度遠大于SNAI1（圖2B，E）。

此外，為了確定SNAI2/SNAI1是否在轉錄水平上抑制ELF3 / ELF3-AS1，在SNAI1和SNAI2過表達細胞系中進行雙熒光素酶和CHIP測定。如圖2G所示，當SNAI1/2結合序列發生突變時，SNAI1/2過表達對熒光素酶表達的強烈抑制部分恢復，提示該序列是SNAI1/SNAI2抑制ELF3/ELF3-AS1表達所必需的。另一方面，CHIP測定表明SNAI1和SNAI2可以直接與ELF3-AS1啟動子結合（圖2H-J）。綜上所述，SNAI2和SNAI1都參與了GC中ELF3和ELF3-AS1的轉錄調控。

圖2 ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉錄抑制

3. ELF3-AS1和ELF3表達降低預示GC預后不良

由于ELF3和ELF3-AS1被EMT相關轉錄因子SNAI1/2抑制，作者進一步進行了ELF3/ELF3-AS1與EMT生物標志物的基因表達相關性分析。正如預期的那樣，ELF3和ELF3-AS1都與上皮生物標志物高度共表達（圖3A)。

此外，對30對GC組織中ELF3-AS1表達的分析表明，與相應的正常樣品相比，ELF3-AS1在超過80%的GC樣品中下調（圖3B）。另一方面，作者分析了癌癥基因組圖譜（TCGA，n = 375）數據庫中GC樣本中ELF3-AS1下調的臨床意義。LncRNA ELF3-AS1在彌漫性和低分化的GC組織中表達低（圖3C和D）。總生存期分析表明，ELF3-AS1表達水平較低的GC患者總生存時間較短（圖3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起腫瘤抑制作用。在此，作者進一步確認了ELF3在GC中的表達顯著下調（圖3F，G）。此外，與腸道GC相比，在彌漫性GC中觀察到ELF3的表達較低（圖3H）。3ELF3的低表達與GC的惡性進展呈正相關（圖3I，J）。ELF3表達較低的GC患者總生存時間和無病生存時間較差GSE62254GC隊列（圖3K）。臨床分析與作者的發現非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉錄抑制。

圖3 ELF3-AS1和ELF3表達降低與GC預后不良相關

4. 上皮轉錄因子ELF3在GC中發揮腫瘤抑制作用

反義lncRNA通常與其相鄰的蛋白質編碼基因高度共表達。同樣，作者還觀察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃組織，GC細胞系和泛組織中存在高共表達（圖4A-E）。有趣的是，當ELF3-AS1在GC細胞系中被有效敲低時，ELF3 mRNA及其蛋白質顯著降低至約60-70%（圖4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影響GC中的ELF3表達。

此外，對30對GC組織中ELF3-AS1表達的分析表明，與相應的正常樣品相比，ELF3-AS1在超過80%的GC樣品中下調（圖3B）。另一方面，作者分析了癌癥基因組圖譜（TCGA，n = 375）數據庫中GC樣本中ELF3-AS1下調的臨床意義。LncRNA ELF3-AS1在彌漫性和低分化的GC組織中表達低（圖3C和D）。總生存期分析表明，ELF3-AS1表達水平較低的GC患者總生存時間較短（圖3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起腫瘤抑制作用。在此，作者進一步確認了ELF3在GC中的表達顯著下調（圖3F，G）。此外，與腸道GC相比，在彌漫性GC中觀察到ELF3的表達較低（圖3H）。ELF3的低表達與GC的惡性進展呈正相關（圖3I，J）。ELF3表達較低的GC患者總生存時間和無病生存時間較差GSE62254GC隊列（圖3K）。臨床分析與作者的發現非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉錄抑制。

5. 上皮轉錄因子ELF3在GC中發揮腫瘤抑制作用

反義lncRNA通常與其相鄰的蛋白質編碼基因高度共表達。同樣，作者還觀察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃組織，GC細胞系和泛組織中存在高共表達（圖4A-E）。有趣的是，當ELF3-AS1在GC細胞系中被有效敲低時，ELF3 mRNA及其蛋白質顯著降低至約60-70%（圖4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影響GC中的ELF3表達。

鑒于ELF3屬于ETS轉錄因子家族，作者最初假設ELF3-AS1和ELF3的共表達可能是由于ELF3調節ELF3-AS1的表達。為了驗證這種可能性，在兩個GC細胞系中進行了關于ELF3的功能喪失和功能獲得研究。然而，在GC中敲低或過表達ELF3后，ELF3-AS1的表達沒有顯著改變（圖4J和K）。盡管轉錄因子ELF3不能調節ELF3-AS1的表達，但劃痕傷口愈合測定和Transwell測定證實ELF3在GC細胞遷移和侵襲中具有腫瘤抑制作用（圖4L和M）。

圖4 ELF3負調節細胞轉移，但不能調節GC中ELF3-AS1的表達

6. ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號傳導抑制GC轉移

作者通過miRNA測序分析了ELF3-AS1敲低后差異表達的miRNA（圖5A）。令人驚訝的是，在ELF3-AS1耗竭大幅下調的前10種miRNA中，miR-33a，miR-33b和miR-203a是眾所周知的靶向SNAI2的miRNA（圖5B）。為了確認miRNA測序的可靠性，作者檢查了ELF3-AS1去除細胞系中miR-33a，miR-33b和miR-203a的表達水平。結果表明，ELF3-AS1敲低確實能顯著降低miR-33a、miR-33b和miR-203a的表達（圖5C-E）。相應地，ELF3-AS1的耗竭導致SNAI2 mRNA和蛋白質的顯著上調（圖5F-H）。一致地，分析來自另一項獨立研究的RNA-seq數據（GSE92250）還表明ELF3-AS1敲低導致A549和Hela細胞系中的SNAI2 mRNA上調（圖5I），表明ELF3-AS1對SNAI2表達的負調控可能在癌癥中廣泛存在。

基于上述發現，作者推測ELF3-AS1可能通過抑制SNAI2信號傳導來抑制GC進展。為了驗證這種可能性，在體內和體外進行了救援測定。敲低SNAI2表達挽救了ELF3-AS1去除的GC細胞系的致瘤特性（圖5J和K）。這些數據強烈表明，ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號傳導來抑制GC細胞的遷移和侵襲。

圖5ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號傳導來抑制GC轉移

7. 核定位的lncRNA ELF3-AS1在細胞周期進程中起關鍵作用。

lncRNA的生物學功能與其亞細胞位置密切相關。ELF3-AS1是GC中的核定位lncRNA（圖6A和B）。之前的一項研究報道，ELF3-AS1是一種細胞周期相關的lncRNA。作者的研究還表明，lncRNA ELF3-AS1在細胞周期進程中起著至關重要的作用。ELF3-AS1敲低顯著加速了GC中細胞周期的G1/S轉變（圖6C和D）。有趣的是，RNA-seq分析表明，敲低ELF3-AS1導致幾乎所有組蛋白編碼基因的顯著上調超過2倍（圖6E和F）。眾所周知，組蛋白的合成發生在細胞周期的S期，與DNA復制同步。這些結果表明，ELF3-AS1通過影響G1/S轉換和組蛋白合成來負調節GC細胞的細胞周期進程。

為了更好地理解ELF3-AS1調控細胞周期過程的分子機制，作者分析了ELF3-AS1敲低后細胞周期相關基因的表達變化。結果表明，敲低ELF3-AS1增加了GC中CDK6和CASP7的表達，但降低了CDKN1A（也稱為p21）的表達（圖6G和H）。p21蛋白作為G1/S轉變的細胞周期檢查點。CDK6/CCND1蛋白復合物對細胞周期G1相進展和G1/S轉變非常重要。因此，ELF3-AS1敲低引起的G1/S轉變的促進可能是由于P21的下調和CDK6的上調.

圖6 核定位的lncRNA ELF3-AS1通過影響G1 / S過渡和組蛋白合成來調節細胞周期進程

8. ILF2/ILF3復合物可直接調節ELF3-AS1/ELF3 RNA雙鏈體的穩定性

通過RNA下拉分析鑒定了與lncRNA ELF3-AS1相互作用的潛在蛋白質。根據位于45道爾頓處的差分帶的質譜（MS）分析（圖7A），有7種蛋白質匹配覆蓋率大于20%。在這些蛋白質中，RINI，ILF2（也稱為NF45）和TARBP2是雙鏈RNA（dsRNA）結合蛋白（圖7B）。有趣的是，另一種名為ILF3的蛋白質（也稱為NF90 / NF110）也出現在該條帶的MS結果中（圖7C）。作者隨后的蛋白質印跡測定進一步驗證了ILF2，ILF3和TARBP2可以與外源性lncRNA ELF3-AS1結合（圖7D）。此外，CHIRP下拉試驗證實內源性ELF3-AS1也與ILF2和ILF3蛋白結合（圖7E和F）。維恩圖顯示，在三個MS結果的交點處顯示了大約22種蛋白質，包括ILF2，ILF3，RINI等（圖7F）。為了弄清楚ELF3-AS1轉錄本的哪個區域可以與ILF2和ILF3相互作用，作者截斷了不同長度的ELF3-AS1轉錄本。在通過蛋白質印跡分析了不同長度的ELF3-AS1轉錄本拉下的蛋白質后，作者發現第一個外顯子區域對于ELF3-AS1轉錄本與ILF2 / ILF3復合物之間的相互作用是必需的（圖7G）。此外，作者在轉染不同長度的ELF3-AS1轉錄本的GC細胞中檢測到ELF3表達。結果表明，僅過表達含有外顯子1的ELF3-AS1轉錄本上調ELF3表達（圖7H）。RNA免疫沉淀測定顯示，與ILF2和ILF3蛋白結合的ELF3-AS1轉錄本比對照IgG組高數千倍（圖7I，J）。

圖7 ELF3-AS1直接與ILF2 / ILF3蛋白復合物相互作用

由于選擇性剪接，ELF3基因具有不同的轉錄本。在這些不同類型的ELF3轉錄本中，ELF3-201，ELF3-202和ELF3-203可以編碼全長ELF3蛋白。ELF3-201轉錄本和ELF3-AS1轉錄本重疊約664個核苷酸（圖8A）。換句話說，ELF3-AS1可以與ELF3-201的第一外顯子區結合形成雙鏈RNA分子。另一方面，RNA-seq分析表明，與ELF3-203或任何其他ELF3轉錄本水平相比，ELF3-AS1的敲低對ELF3-201表達的影響更深遠（圖8B）。這些數據暗示ILF2 / ILF3復合物可能與ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA結合。為了進一步驗證這種可能性，作者還檢查了ILF2 / ILF3的RIP測定中的ELF3-201轉錄本水平。與ILF2和ILF3結合的ELF3-201轉錄本遠高于對照IgG組（圖8C，D），表明ILF2 / ILF3復合物可以與ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA結合。

據報道，ILF2/ILF3復合物在調節mRNA穩定性中起重要作用。RNA-seq數據和qPCR檢測表明，ILF3的敲低顯著降低了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平，而ILF2的敲低顯著提高了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平（圖8E-G）。這些結果表明，ILF2和ILF3蛋白對ELF3-AS1轉錄本的穩定性具有相反的影響。先前的一項研究報道，NF45在ILF2/ILF3復合物中作為調節亞基起作用。有趣的是，作者還注意到ILF2的敲低可能會影響ILF3基因的選擇性剪接（圖8H）。因此，推測ILF2可能通過影響ILF3基因的選擇性剪接來調控ELF3-AS1和ELF3-201的表達。

圖8 ILF2/ILF3與ELF3-AS1/ELF3 RNA雙鏈體相互作用，影響RNA雙鏈體的穩定性

結論：

綜上所述，在GC中發現了SNAI2和lncRNA ELF3-AS1之間新的雙負反饋環。SNAI2-ELF3-AS1反饋環通過連續激活SNAI2信號傳導并在轉錄和轉錄后水平調節ELF3表達來驅動GC轉移。在GC中，SNAI2過表達，導致ELF3和ELF3-AS1的表達水平降低。反過來，ELF3-AS1下調通過持續激活SNAI2信號傳導和促進細胞增殖進一步推動腫瘤進展，從而導致GC預后不良。

參考文獻：

Li D, Shen L, Zhang X, Chen Z, Huang P, Huang C, Qin S. LncRNA ELF3-AS1 inhibits gastric cancer by forming a negative feedback loop with SNAI2 and regulates ELF3 mRNA stability via interacting with ILF2/ILF3 complex. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 2;41(1):332. doi: 10.1186/s13046-022-02541-9.