結核分枝桿菌（Mtb）引起的結核病仍然是全球十大死亡原因之一，并且在當前COVID-19以前是單一感染原的主要原因。GSH過氧化物酶4（Gpx4）是一種在預防鐵依賴性脂質過氧化介導的細胞死亡中發揮關鍵作用的酶。本研究說明Gpx4調控的壞死在Mtb感染中的有害作用，并確定Gpx4/GSH抗氧化軸作為宿主定向治療結核病干預的候選靶點。文章于2022年11月發表在期刊《Journal of Experimental Medicine》上，IF：11.45。

技術路線：

主要研究結果：

1、肺結核患者GPX4/GSH及脂質過氧化水平與肺部疾病的關系

作為評估GPX4在調節脂質過氧化和結核病中潛在作用的第一步，作者首先分析巴西和南非不同隊列的結核病患者該途徑中的元素。作者采用酶基測定法觀察巴西隊列，發現與HC相比，肺結核（PTB）患者血漿中GSH水平降低（圖1A），脂質過氧化水平升高（圖1B）。進一步分析，PTB患者體內的GSH和脂質過氧化物（MDA）水平呈現一個負相關，但HC樣本中沒有（圖1C）。

接下來根據疾病嚴重程度和肺受損狀況對巴西PTB患者進行分層。該分析顯示在重度與非重度或單側與雙側肺病理學上GSH和脂質過氧化水平表現出明顯的差異（圖1D-E），GSH水平下降與脂質過氧化增強與更嚴重的疾病密切相關。此外，主成分分析證實該患者隊列中疾病嚴重度、脂質過氧化和GSH水平三者之間的相關性（圖1F-G）。這些發現支持人類感染Mtb疾病與GSH調節的脂質過氧化作用相關聯，該過程由GPX4進行生化調節。

此外，qRT-PCR顯示患有嚴重疾病的巴西隊列的GPX4 mRNA水平顯著降低（圖1H）。為評估GPX4在PTB疾病中的位置，作者檢測巴西PTB病人時候的肺組織，用該酶特異性多克隆抗體孵育后，在肉芽腫邊緣的細胞中觀察到強烈的GPX4染色，其共定位區域為CD68陽性。相反，在壞死核周圍的區域觀察到GPX4染色極少（圖1I）。因此，與HC相比，PTB患者GSH/GPX4反應與脂質過氧化異常。

圖1 PTB患者GSH/GPX4反應與脂質過氧化異常

2、Gpx4在感染Mtb的NHPs和高壞死B6.Sst1^s老鼠肺組織中的表達定位

為進一步拓展對TB病人的認識，作者同樣評估感染H37Rv-mCherry Mtb毒株16周后恒河猴肺組織切片GPX4蛋白的表達。從這些動物分離的細胞肉芽腫顯示，與位于肉芽腫周圍的細胞相比，Gpx4在肉芽腫中心的染色減少（圖2A）。值得注意的是，根據感染動物的肺組織切片中GPX4的形態和位置，在類似肺泡巨噬細胞的細胞中檢測到GPX4的強烈染色（圖2A，左）。此外，從這些恒河猴中獲得的壞死肉芽腫在肉芽腫內的活細胞中也表現出更強的GPX4染色（圖2A，右）。

為評估Gpx4在小鼠模型中的壞死病理學表達，作者用被氣溶膠感染H37Rv Mtb強毒株35 d后的B6.Sst1S小鼠，進行肺組織學檢查。雖然該動物品系的整體肺組織病理學不同于NHPs（非人靈長類動物）和人類，但再次觀察到肉芽腫病變中心部位的Gpx4染色減少，而位于邊緣的細胞和肉芽腫周圍的肺組織區域的酶染色增強（圖2B，左、中）。有趣的是，在肉芽腫內發生壞死的細胞中觀察到Gpx4染色減少（圖2B，右）。總之，這些觀察揭示實驗感染動物肺肉芽腫組織中GPX4空間細胞表達的差異，這將與該酶在調節發病機制中的作用相一致。

圖2：Gpx4在感染Mtb恒河猴和B6. Sst1^s老鼠的肉芽腫肺組織中表達空間分布

3、過表達該酶的小鼠肺部病理降低時，Gpx4全基因缺失的感染Mtb小鼠表現出組織壞死增加

為評估Gpx4在Mtb誘導的疾病中的功能作用，作者檢測在整體動物或特定細胞區室酶缺陷或轉基因過表達Gpx4的小鼠中分枝桿菌感染的結果。

首先研究cre-ERT2posGpx4f1/f1小鼠，tamoxifen治療后，Gpx4在整個動物（大腦除外）的表達出現整體下降（圖3A）。當被氣溶膠感染時，與類似感染的非缺陷floxed小鼠（Gpx4f1/f1）相比，這些小鼠的肺部和脾脹均顯示明顯增加的細菌負荷（圖3B-C）。此外，與對照動物的相似染色切片相比，Gpx4缺陷小鼠肺細胞外環境中AFB的數量大幅增加（圖3D）。定量分析切片顯示，在Gpx4缺陷的肺中，實質區大小和Mtb感染的肉芽腫組織顯著增大（圖3E-F）。重要的是，與對照組相比，Gpx4缺陷小鼠肺中每個細胞的細菌數量顯著增加（圖3G）。此外，流式細胞術分析顯示，所有Gpx4缺陷動物的肺單細胞懸液中，通過LAA染色測定的CD11b+細胞中脂質過氧化水平增加（圖3H）。

下面用Gpx4轉基因的小鼠檢測Gpx4過表達的影響。與WT非轉基因對照小鼠相比，這些動物雙肺和脾脹的細菌負荷均有所減少（圖3I-J）。SytoxGreen染色測定肺壞死減少（圖3K-L）。對Gpx4轉基因小鼠肺組織均漿的多重蛋白分析顯示，與WT相比，許多與炎癥反應相關的細胞因子和趨化因子的水平顯著降低（圖3M）。有趣的是，與WT動物相比，感染的轉基因小鼠還顯示出更多的肺泡巨噬細胞（AMs）（圖3N）。這提示Gpx4在Mtb感染過程中調節這些細胞的命運中起作用。流式細胞術檢測，感染Mtb的Gpx4轉基因小鼠的肺中AM和間質巨噬細胞（IMs）的脂質過氧化染色也出現下降（圖3O）。

圖3 Gpx4基因整體表達的改變調節宿主對Mtb感染的耐藥性

4、髓系間室中Gpx4缺失導致Mtb感染小鼠的宿主抵抗力降低和組織壞死增加

Gpx4在肺內的多個細胞系中表達（圖4A），可能通過調節對病原體的氧化應激反應來潛在地影響宿主對Mtb的抗性。為評估髓系細胞Gpx4相對于其他產生酶的細胞群的特異性貢獻，作者在一系列條件敲除小鼠中檢測Mtb感染的結果，這些小鼠具有基因工程的Cre-loxP元件，以靶向Gpx4在含譜系的髓系細胞中的表達。

當通過氣溶膠感染H37Rv菌株，CD45creGpx4fl / fl小鼠表現出明顯增強的Mtb易感性，幾乎比非Gpx4缺陷的floxed對照動物早4個月死亡（圖4B）。這種抵抗力的喪失與肺和脾臟中細菌負荷的顯著升高以及45 d p.i時明顯的肺壞死有關（圖4C-E），這讓人聯想到上面在感染的cre-ERT2+Gpx4fl/fl小鼠中觀察到的情況。與這些發現一致的是，與感染非缺陷型Gpx4f1/f1動物相比，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠的肺勻漿顯示促炎細胞因子和趨化因子水平升高，最顯著的變化發生在IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平以及KC/CXCL1和MCP-1/CCL2（圖4F）。此外，流式細胞術分析顯示，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠肺中AM的頻率和數量顯著減少（圖4G-H），同時IM增加（圖4G-I）。有趣的是，這些動物在肺髓樣腔室中也表現出Ly6G表達細胞的優先富集（圖4J）。雖然認為這些CD45creGpx4fl/fl動物中Gpx4缺乏的影響并非髓系細胞所特有，但通過LAA染色測量和流式細胞術分析，研究的每個個體髓系細胞群均顯示脂質過氧化增加（圖4K）。

作者接下來檢查LysMcreGpx4fl/fl小鼠的Mtb感染，該小鼠在骨髓隔室中特異性地顯示出Gpx4表達缺陷。盡管其表型不如在CD45 creGpx4fl/fl小鼠中觀察到的嚴重，但LysMcreGpx4fl/fl小鼠也表現出對Mtb感染的易感性增加，如120 p.i.時死亡率增加以及肺和脾細菌負荷增加（圖5A-B）。此外，對這些動物的肺組織病理學檢查顯示單個核細胞中抗酸細胞數量增加（圖5C）。流式細胞術對單細胞懸浮液進行分析，Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠中對活的IM總數量無變化（圖5D, F），120 p.i.時表現出AM的深度消耗（圖5D-E）。此外，在這些動物的IM中檢測到脂質過氧化物水平升高，同時IM標記染色的死亡細胞數量增加（圖5G-H）。中性粒細胞在Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠的肺實質中富集，同時也表現出脂質過氧化增強和在肺實質中積累為死細胞（圖5I-K）。然而，在Mtb-infected LysMcreGpx4fl/fl小鼠的肺部觀察到的炎癥表型似乎不是Gpx4對中性粒細胞的作用引起的，因為Gpx4缺陷是專門針對Mtb-infected Mrp8 creGpx4fl/fl小鼠細胞的，在生存和細菌負荷方面，均未檢測到的宿主對病原體的抗性損失（圖5L-M）。

總之，這些發現表明Gpx4在巨噬細胞/單核細胞，而不是中性粒細胞中的細胞內在表達，對于研究Mtb感染中的宿主抗性的實驗是重要的。

圖4造血腔內Gpx4表達的缺失增強宿主對Mtb感染的易感性

圖5 Gpx4表達對體內巨噬細胞抵抗Mtb感染具有重要作用

5、髓系靶向缺失Gpx4表達的Mtb感染小鼠BMDMs表現出增強的鐵死亡

Gpx4是細胞鐵死亡的調控中心，之前的體內體外實驗都發現Mtb感染引發的細胞壞死。為正式測試Gpx4在Mtb誘導的細胞死亡中的作用，作者研究來自骨髓細胞中Gpx4靶向缺失的LysMcreGpx4fl/fl和CD64creGpx4fl/fl小鼠的BMDMs。流式細胞術分析，當感染多重度（MOI）為5時，來自這些小鼠品系的巨噬細胞培養在第1天和第4天均顯示出Mtb誘導的細胞死亡增強（圖6A-B）。這種增強的細胞壞死與線粒體超氧化物水平升高以及脂質過氧化升高有關（圖6C-D），且導致細胞外環境中細菌負荷增強（圖6E）。有趣的是，當MOI為1時，對感染Mtb的培養物進行檢測，發現在兩種條件敲除的巨噬細胞群體中，Gpx4表達的缺失也被發現與胞內細菌生長增加有關。這種效應被治療抑制ferrostatin-1（Fer-1；圖6F）。重要的是，在高MOI的Mtb感染的Gpx4缺失巨噬細胞培養物中，Fer-1的加入顯著抑制細胞壞死的增加（圖6G-I）。總之，這些體外觀察支持Gpx4在調節Mtb誘導的細胞鐵死亡中的主要作用，同時揭示該酶在控制細胞內細菌生長方面的潛在功能。

圖6 Gpx4缺失在體外Mtb感染的巨噬細胞中觸發脂質過氧化依賴性壞死和細菌控制的喪失

結論:

綜上所述，作者研究Gpx4調節的脂質過氧化與mtb4感染人類以及小鼠肺結核實驗模型中宿主耐藥性和疾病的關系，并從Mtb4感染的NHPs肺切片中酶的組織染色中提供支持數據。作者發現更嚴重疾病的患者表現出外周血單個核細胞循環單核細胞中GPX4表達減少，GSH減少以及血漿中脂質過氧化物水平升高。進一步證明，在體內和體外，Gpx4表達的降低與壞死、脂質過氧化和細菌生長的增加有關，而Gpx4表達的增強在體內具有相反的結果。通過條件敲除小鼠以及體外感染實驗，揭示髓系細胞的Gpx4表達在決定這些結果中起著核心作用。這些發現支持鐵死亡在Mtb誘導的細胞壞死中的作用，并暗示Gpx4/GSH軸是結核病的宿主定向治療的靶點。

參考文獻

Amaral EP, Foreman TW, Namasivayam S, Hilligan KL, Kauffman KD, Barbosa Bomfim CC, et al. (2022). GPX4 regulates cellular necrosis and host resistance in Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med; 219(11):e20220504. doi: 10.1084/jem.20220504.