組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1 (LSD1)在胃癌(GC)中的表達明顯升高，可能與胃癌的增殖和轉移有關。據報道，LSD1在黑色素瘤和乳腺癌中通過程序性細胞死亡1配體1 (PD-L1)抑制腫瘤免疫。LSD1在胃癌免疫微環境中的作用尚不清楚。本研究中采用免疫組化(IHC)和免疫印跡(Western Blot)分析胃癌患者LSD1和PD-L1的表達情況。通過體內探索，LSD1 KO(敲除)的小鼠前胃癌(MFC)細胞在615只小鼠體內的生長明顯慢于T細胞缺失的BALB/c裸鼠。同時在GC標本中，LSD1的表達與CD8的表達呈負相關，與PD-L1的表達呈正相關。進一步研究表明，LSD1通過誘導外泌體中PD-L1的積累，抑制T細胞在GC微環境中的反應，而在GC細胞中，膜PD-L1保持不變。使用外泌體作為載體，LSD1也阻礙了其他癌細胞的T細胞反應，而LSD1的缺失挽救了T細胞的功能。研究發現，外泌體在依賴供體細胞中LSD1存在的情況下，可調節MFC細胞增殖，其作用與體內外泌體PD-L1介導的T細胞免疫有關。上述結果表明，LSD1缺失降低胃癌外泌體PD-L1，恢復T細胞應答；這一發現提示了LSD1可能調控胃癌腫瘤免疫的新機制，為胃癌的免疫治療提供了新的靶點。本文于2022年3月發表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術路線：

主要研究結果：

(1) LSD1的去除通過抑制GC中T細胞的反應來抑制腫瘤的生長

為了確定LSD1在GC中對腫瘤免疫的調節作用，使用TIMER2.0平臺分析了LSD1和免疫細胞信號之間的相關性。在各種免疫細胞中，LSD1與腫瘤浸潤CD8+ T細胞呈負相關，主要發生在GC中(圖1a)。癌癥基因組圖譜數據庫分析發現，胃癌中LSD1的mRNA與CD8和CD3的mRNA表達呈負相關(圖1b)。因此，LSD1被認為是通過抑制T細胞反應來維持腫瘤的生長。在人GC細胞系BGC-823和MGC803以及MFC細胞系中建立LSD1 KO細胞系(補充圖未展示)。分別將MFC和MFC LSD1 KO細胞皮下接種于615只小鼠和T細胞缺陷BALB/c裸鼠。在BALB/c裸鼠中，MFC LSD1 KO組的腫瘤重量和體積與MFC組相當，而在615只小鼠中，MFC LSD KO組的腫瘤幾乎完全根除(圖1c,d)，而它們的體重保持一致(補充圖未展示)。這些結果表明，LSD1可能通過抑制T細胞反應來維持腫瘤的生長。此外，將人GC細胞與抗CD3/CD28珠激活的T細胞共孵育，無論LSD1是否被敲除，BGC-823和MGC-803細胞在體外都能穩定生長(圖1e)，而當LSD1缺失時，這兩種癌細胞更容易被激活的T細胞殺死(圖1f)。通過分析圖1c中615只小鼠的剝脫腫瘤，LSD1的缺失導致CD8+ T細胞浸潤增加(圖1g)。綜上所述，LSD1是GC中T細胞應答的抑制因子，LSD1的缺失可能通過促進T細胞在體內外殺傷能力而顯著抑制GC細胞的生長。

圖1：LSD1 KO可通過促進胃癌中T細胞的應答抑制腫瘤生長

(2) GC標本中LSD1與CD8呈負相關，與PD-L1呈正相關

為了探討LSD1如何影響腫瘤浸潤的CD8+ T細胞水平，我們在用我們內部GC標本構建的組織微陣列(TMA)阻滯劑上進行免疫組化，分析LSD1、CD8和T細胞吸引趨化因子、C-X-C基序趨化因子9 (CXCL9)和C-X-C基序趨化因子10 (CXCL10)的表達。圖2a,b表明，LSD1在GC組織中過表達，與CD8呈負相關(圖2c)，而CXCL9和CXCL10在GC組織中幾乎不表達(補充圖未展示)。由于抑制LSD1刺激抗腫瘤免疫，增強PD-1/PD-L1阻滯劑在乳腺癌和黑色素瘤中的抗腫瘤療效，而PD-L1是免疫治療的有效靶點，可通過結合PD-1抑制T細胞激活，我們推測LSD1可能主要通過抑制PD-L1激活和增殖T細胞而參與胃癌的發展。為探討胃癌中LSD1與T細胞輔抑制因子PD-L1的相關性，收集36例胃癌標本進行進一步分析。圖2d表明，腫瘤組織中LSD1和PD-L1的表達高于癌旁組織，且PD-L1與LSD1呈正相關(圖2e)。在TCGA數據庫中，PD-L1的表達也與GC中LSD1 mRNA的表達呈正相關(圖2f)。這些結果初步支持了我們的假設，LSD1和PD-L1之間可能存在調節關系。

圖2：胃癌標本中LSD1表達與免疫調節基因呈正相關

(3) 抑制LSD1可下調GC中PD-L1的水平

為了進一步探討LSD1對GC中PD-L1的調控作用，我們對GC細胞中總PD-L1和膜PD-L1進行了量化。如圖3a,b所示，不同GC細胞系中總PD-L1和膜PD-L1表達明顯不均。為了研究LSD1對PD-L1的調節作用，通過使用LSD1抑制劑GSK2879552(圖3c,d)或使用sgRNA基因抑制LSD1(圖3e,f)。當LSD1被廢去后，PD-L1的表達在mRNA水平和蛋白水平上均被下調。膜PD-L1的表達水平沒有顯著變化(補充圖未展示)。已有研究報道PD-L1可通過蛋白酶體和溶酶體途徑降解，但LSD1抑制劑是否影響PD-L1的降解途徑尚不清楚。采用蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺(CHX)和溶酶體抑制劑氯喹(CQ)處理GC細胞。LSD1的缺失并沒有減少蛋白酶體和溶酶體對PD-L1的降解(補充圖未展示)。為了探究LSD1在內體轉運中的作用，我們檢測了恢復內體標志蛋白RAB11和多泡小體標志蛋白TSG101。LSD1缺失可增加RAB11的表達，PD-L1與RAB11和TSG101在細胞質中共定位(補充圖未展示)。SEM結果還顯示，敲除LSD1后，多泡體數量減少(圖3g,h)，刪除LSD1后，TSG101表達減少(圖3i)。以上結果表明，LSD1的缺失可以降低PD-L1的總表達量，維持細胞膜PD-L1水平，減少細胞外通過多泡體分泌PD-L1，促進PD-L1在GC細胞中向膜循環。

圖3：抑制LSD1可下調GC中PD-L1基因水平

(4) LSD1缺失下調GC中外泌體PD-L1

已有研究報道外泌體PD-L1也可發揮免疫抑制功能。PD-L1通過外泌體作為載體分泌，可能受LSD1調控。從GC細胞中分離出的外泌體，進行掃描電鏡和NTA分析。GC細胞衍生的外泌體的大小在30到200 nm之間(圖4a,b)。使用蔗糖梯度離心純化的外泌體進行的進一步分析表明，外泌體標記CD63、ALG-2相互作用蛋白X (ALIX)和CD9在20-40%的蔗糖餾分中移動，PD-L1與這些外泌體標記共定位(圖4c)。PD-L1被打包到GC細胞的外泌體中，PD-L1積累在來自幾個人GC細胞系的外泌體中(圖4d)。為了進一步證實外泌體中的PD-L1來自癌細胞而非其他成分，采用外泌體分泌抑制劑GW4869抑制胞外囊泡的分泌，當從相同數量的細胞中純化外泌體時，外泌體分泌明顯減少，當BGC-823細胞暴露于GW4869時，觀察到膜PD-L1和總PD-L1(補充圖未展示)的顯著積累。在被抑制的BGC-823和MGC-803細胞中，當LSD1在基因上(圖4e)和藥理學上(圖4f)被刪除時，外泌體PD-L1被降低，表明LSD1在正向調節外泌體PD-L1的積累方面具有潛在作用。使用基于磁珠的方法從LSD1缺失的BGC-823和MGC-803細胞中收集的外泌體也比野生型細胞的外泌體含有更少的PD-L1(圖4g,h)。當LSD1缺失時，GC細胞來源的外泌體濃度降低(圖4i)。因此，我們認為LSD1 KO可以維持細胞膜PD-L1的同時減少外泌體的分泌，抑制外泌體分泌有可能挽救這種作用。用GW4869處理BGC-823細胞，對膜PD-L1進行定量。去除LSD1可以減少PD-L1總量(圖3d,f)，但保持膜PD-L1(補充圖未展示)。使用GW4869抑制外泌體分泌可以誘導BGC823細胞中膜PD-L1的積累，GW4869還可以在LSD1缺失的BGC-823細胞中重新誘導膜PD-L1的積累(圖4j)。綜上所述，PD-L1存在于GC細胞衍生的外泌體中，LSD1的去除減少了細胞總PD-L1的量，但保持了膜PD-L1，并減少了外泌體PD-L1的分泌和積累。

圖4：LSD1缺失下調GC中外泌體PDL1

(5) LSD1的缺失逆轉了GC衍生的外泌體PD-L1的直接T細胞應答抑制

為保證外泌體PD-L1功能的保留，采用PD-1/PD-L1結合試驗檢測外泌體PD-L1與PD-1的結合能力。標記有PKH26的GC細胞外泌體與重組PD-1涂層的孔結合，當BGC-823細胞中LSD1被刪除時，這種結合可以顯著取消(圖5a)。用GC細胞源性外泌體孵育的T細胞的SEM圖像也驗證了GC細胞源性外泌體可以直接與T細胞結合，而LSD1 KO消除了這種相互作用(圖5b)。為了確定LSD1是否可以通過TCR途徑調節外泌體PD-L1介導的免疫抑制作用，采用抗CD3/CD28珠激活健康人體供體PBMCs，并與B-EXO共孵育，用于T細胞刺激模型，并測定T細胞的激活和增殖。以CD8+ T細胞的激活標記CD69為代表，抗CD3/CD28珠大大提高了CD69的表達，B-EXO處理后CD8+ T細胞中CD69表達明顯下調，而B KO-EXO或用PD-L1抗體或PD-1重組體阻斷外泌體PD-L1的作用挽救了CD8+ T細胞中被抑制的CD69表達(圖5c)。T細胞增殖在B-EXO存在時下降，而在LSD1缺失時沒有，說明GC細胞源性外泌體的免疫抑制功能被LSD1 KO去除(圖5d)，這與外泌體中PD-L1的表達水平一致。為了進一步證實外泌體可以調節T細胞的GC細胞殺傷能力，將激活的PBMCs與GC細胞共培養，并在存在或不存在LSD1的情況下，用BGC-823細胞來源的外泌體處理。外泌體可以減少T細胞殺傷以保持GC細胞存活，而B KO-EXO由于PD-L1的表達極少，對T細胞殺傷沒有影響(圖5e,f)。T細胞激活過程中分泌的三種主要反應性細胞因子IL-2(圖5g)、IFN-γ(圖5h)和TNFα(圖5i)的分泌也可以被B-EXO抑制，并被B KO-EXO挽救。這些結果一致表明，GC細胞衍生的外泌體可以直接抑制TCR介導的T細胞激活，依賴于LSD1調節的外泌體PD-L1。

圖5：LSD1的缺失逆轉了GC衍生的外泌體PD-L1的直接T細胞應答抑制

(6) LSD1的缺失通過影響靶細胞中PD-L1的表達，逆轉了GC細胞來源的外泌體在T細胞應答中的抑制作用

為了探索GC來源的外泌體向其他癌細胞的轉運功能，我們用熒光PD-L1抗體對B-EXO和B KO-EXO進行染色，并與GC細胞系MGC-803孵育。外泌體PD-L1被轉運到目標GC細胞中(圖6a)。B-EXO可以誘導靶細胞中膜PD-L1的積累，而B-KO-EXO處理的BGC-823細胞中沒有顯著的PD-L1積累(圖6b)；在總PD-L1上也看到了類似的作用(圖6c,d)。當B-EXO處理后，PD-1與細胞表面的結合顯著增加，而PD-1在B KO-EXO處理的細胞上的結合則保持不變(圖6e,f)。活化的T細胞與B-EXO處理的BGC823細胞共孵育時，CD3+CD8+ T細胞中CD69的表達降低，而B KO-EXO處理的細胞組中CD69的表達沒有降低(圖6g)。輔助T細胞殺傷分析的表型分析也表明，B-EXO處理的GC細胞有逃避T細胞殺傷的意圖，而B KO-EXO對癌細胞對T細胞殺傷的敏感性沒有顯著影響(圖6h)。這些結果表明，外泌體中的PD-L1可以運輸到其他癌細胞中，從而誘導腫瘤細胞從T細胞的免疫逃逸，而LSD1的缺失降低了GC細胞來源的外泌體的免疫抑制功能，這說明LSD1是一種潛在的腫瘤免疫治療的免疫抑制因子。

圖6：LSD1的缺失通過影響靶細胞中PDL1的表達，逆轉了GC細胞來源的外泌體在T細胞應答中的抑制作用

(7) LSD1缺失GC細胞的外泌體在體內通過外泌體PD-L1促進T細胞介導的腫瘤免疫

鑒于GC細胞衍生的外泌體在體外抑制T細胞的激活，我們進行了一個驗證性的體內實驗。LSD1抑制劑GSK2879552可下調MFC細胞中PD-L1的表達，LSD1缺失可降低外泌體PD-L1的表達，LSD1抑制劑GSK2879552和ORY1001也一樣(補充圖未展示)。我們使用了615只攜帶MFC細胞的小鼠建立胃癌模型，以探索胃癌細胞來源的外泌體是否可以調節體內腫瘤的進展。LSD1 KO顯著抑制了615只小鼠的腫瘤生長。腫瘤的老鼠注射液從MFC細胞明顯大于那些未經治療的腫瘤(MFC組)，而注射MFC LSD1 KO細胞外泌體的小鼠(MFC+KO EXO組)腫瘤比這兩組小得多(圖7a-c)。當MFC和MFC LSD1的外泌體與PD-1孵育以阻塞PD-L1外泌體(MFC+CON EXO+PD-1組和MFC+KO EXO+PD-1組)時，MFC+CON EXO+PD-1組、MFC+KO EXO+PD-1組和MFC+KO EXO組之間的腫瘤體積和腫瘤重量無顯著差異(圖7a-c)。我們推測外泌體治療在一定程度上抑制了腫瘤中CD8+ T細胞的浸潤。與MFC組相比，MFC+CON EXO組CD8+ T細胞比例明顯增加，而LSD1 KO細胞衍生的外泌體促進了CD8+ T細胞的比例(圖7d)。當PD-1重組蛋白阻斷外泌體PD-L1時，MFC+CON EXO+PD-1組CD8+ T細胞比例高于MFC+CON EXO組(圖7d)。MFC+KO EXO組與MFC+KO EXO+PD-1組間CD8+ T細胞比例無明顯差異(圖7d)。腫瘤浸潤性CD3和CD8在這些腫瘤中的表達(圖7e,f)以及細胞因子IL-2和IFN-γ的數量(圖7g,h)的結果一致。攜帶MFC LSD1 KO細胞的小鼠血漿中外泌體PD-L1的表達量遠低于攜帶MFC細胞的小鼠血漿中表達量(圖7i)，提示LSD1具有通過外泌體PD-L1調節全身免疫反應的潛力。總之，LSD1的缺失可以抑制同質GC模型中MFC細胞的增殖。同時，外泌體依靠供體細胞中LSD1的存在，可調節MFC細胞增殖，其作用依賴于體內外泌體PD-L1介導的T細胞免疫。

圖7：來自LSD1被廢的GC細胞的外泌體在體內通過外泌體PD-L1促進T細胞介導的腫瘤免疫

結論：

綜上所述，LSD1的缺失通過減少外泌體中PD-L1的積累來增強T細胞活性，從而抑制腫瘤生長，而在GC細胞中，膜PD-L1保持不變。不僅如此，LSD1以外泌體為載體，通過外泌體PD-L1阻礙了其他癌細胞的T細胞反應，而LSD1的缺失則恢復了T細胞的功能。這些結果揭示了LSD1通過外泌體PD-L1調節T細胞免疫的新途徑，為以LSD1為靶點的GC免疫治療提供了新的策略。

參考文獻：

Shen, D. D., Pang, J. R., Bi, Y. P., Zhao, L. F., Li, Y. R., Zhao, L. J., Gao, Y., Wang, B., Wang, N., Wei, L., Guo, H., Liu, H. M., & Zheng, Y. C. (2022). LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer. Molecular cancer, 21(1), 75. https://doi.org/10.1186/s12943-022-01557-1.