樹突狀細胞（DC）微調炎癥和耐受性反應以保護免疫病理。然而，共同調節因子在維持這種平衡方面的作用尚未得到探討。本研究發現NCoR1及其同源物NCoR2（SMRT）可通過調節STAT3信號通路維持DC炎癥和耐受性反應平衡。本研究于2022年9月發表在《Frontiers in Immunology》IF：8.786期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、SMRT KD cDC1 DCs增強激活/共刺激

構建穩定的Ncor2基因敲除（SMRT KD）和空載體對照的cDC1細胞系。敲除效率在mRNA水平和蛋白水平上得到驗證（圖1A）。然后，用RT-qPCR檢測對照組和SMRT KD cDC1細胞在CpG激活前后2小時和6小時促炎因子（Il12b）和抗炎因子（Il10）mRNA的表達。發現，與對照細胞相比，在SMRT KD cDC1中，CpG刺激后Il12b顯著增加，Il10表達同時減少（圖1A）。此外，流式細胞術分析顯示，與對照組相比，SMRT KD cDC1中的陽性細胞比例和共刺激分子(CD80、CD86和CD40)顯著增加（圖1B）。接下來，通過MHC-II和MHC-I在SMRT KD cDC1中的表達來研究抗原呈遞能力。在CpG和pIC激活過程中，MHC-I陽性細胞比例顯著增加，而MHC-II水平保持不變（圖1）。MHC-II和MHC-I分子的MFI變化也表現出類似的趨勢。在CpG刺激18h后，用流式細胞術檢測CD80、CD86和MHC-II的表達，發現SMRT KD BMcDC1較對照顯著升高，而MHC-I則呈升高趨勢（圖1C）。

圖1 TLR9與CpG-B配對后SMRT缺失的cDC1和BMcDC1的激活和成熟增強

2、SMRT KD cDC1增加促炎因子IL6，IL-12，IL-23而減少IL-10

接下來，檢測了cDC1系和原發系BMcDC1中重要的DC反應細胞因子的表達。發現與對照cDC1比較，CpG和pIC處理6h后，SMRT敲除顯著增強了陽性細胞的比例和和MFI轉變即IL6，IL-12p40，IL-23p19（圖2A）。在未受刺激和CpG激活6h的SMRT KD cDC1中IL-23p19均顯著升高。相反，與對照組相比，CpG和pIC激活的SMRT KD cDC1上IL-10顯著降低（圖2A）。為了進一步估計這些細胞因子在CpG激活的cDC1系培養液中的水平，進行了生物復合物檢測，發現IL-6、IL-12p40和IL-12p70的分泌水平在SMRT KD cDC1中明顯增加，同時IL-10也隨之減少（圖2B）。與DC中的趨勢相似，與對照組相比，在SMRT KD BMcDC1中觀察到陽性細胞百分比顯著增加，IL-6和IL-23的MFI呈增加趨勢，而IL-10的表達減少。然而，在SMRT KD BMcDC1中IL-12p40的陽性細胞及其MFI雖然高于對照組，但并不顯著（圖2C）。這些結果表明SMRT KD cDC1具有很強的炎癥表型。

圖2激活的SMRT KD cDC1顯示炎性細胞因子表達增強

3、OT-II CD4 + Th細胞與SMRT KD cDC1共培養增強Th1和Th17分化

為了解SMRT缺失cDC1對CD4 + Th細胞增殖和分化的功能影響，從OT-II轉基因小鼠脾臟分離純化的CD4 + T細胞與SMRT KD和對照cDC1細胞進行共培養。分離OT-II T細胞，與OVA脈沖和CpG或pIC激活的DC共培養72h檢查增殖，96h檢查分化。在增殖實驗中，我們用efluor-670增殖染料標記OT-II T細胞。

與對照相比，SMRT KD細胞增強T細胞的增殖（圖3A,B）。眾所周知，IL-6抑制FOXP3轉錄因子的表達，從而抑制Treg的分化，并與IL-23一起通過誘導RORgt的表達導致Th17細胞的發育。另一方面，已知IL-12p70上調T-bet導致Th1分化。在OT-II共培養實驗中，發現在CpG激活的SMRT KD cDC1組，CD44+ T-bet + IFN-g +和CD44 + RORgt+ IL-17+細胞的比例增加，其表明Th1和Th17亞型頻率增強的比例顯著高于對照組DC（圖3C-F）。為進一步證實Th17極化增加，檢測了共培養細胞的上清中IL-17細胞因子的分泌水平，發現其水平顯著升高（圖3G）。所有的下游分析都在這些雙陽性細胞中進行。

圖3 SMRT KD cDC1增強了Th1和Th17細胞的體外極化

4、類風濕性關節炎(RA)患者的PBMCs的Ncor2表達降低

RA等自身免疫性疾病被廣泛歸類為Th1和Th17疾病，IL-10的表達在這些患者中也被發現大幅降低。早前已經證實Th1反應與自身免疫性疾病有關。然而，對IFN-g和IL-12-/-小鼠的研究表明，這些小鼠有很高的概率發展為膠原誘導關節炎。本研究中，已經確定了Th17細胞在自身免疫中的作用。因此，為確定Ncor2的表達是否在自身免疫性疾病中發生改變，對11例RA患者和14例健康供體的PBMCs進行了Ncor2的RT- qPCR，結果發現與健康對照比較，RA患者PBMCs中Ncor2表達顯著降低（圖3H）。這一結果提示，在RA疾病中Ncor2的降低可能與炎癥表型的增加有關。

5、SMRT KD cDC1與OT-I CD8⁺ T細胞共培養增加T細胞的細胞毒性

由于觀察到在SMRT耗盡的cDC1中MHC-I表達顯著增加，于是進一步確定這些DC是否有可能增加CD8+ T細胞的細胞毒性。為驗證這一點，從OT-I轉基因小鼠的脾臟中分離出CD8+ T細胞，并將其與對照組和SMRT KD cDC1共培養。首先用SIINFKL (OVA肽257-264)脈沖DC過夜。脈沖DC被CpG或pIC激活2h后與純化的CD8+ T細胞共培養。然后檢測共培養CD8+ T細胞在72h后的增殖和96h后IFN-g、perforin和顆粒酶B（GrB）的表達。使用eFluor 670標記的CD8+ T細胞進行增殖試驗，發現共培養的OT-I CD8+ T細胞增殖未見明顯變化（圖4A,B）。與對照組相比，CpG激活的SMRT KD cDC1共培養的表達IFN-g、perforin和GrB的CD8+ CD44+ T細胞陽性率顯著上調（圖4C）。

圖4 SMRT KD cDC1增加了CD8 T淋巴細胞體外perforin，granzyme和IFN-g的產生

6、過繼轉移CpG脈沖SMRT缺失的cDC1后，OVA誘導的遲發性超敏（OVA- DTH）小鼠足墊炎癥增強，并且降低小鼠B16F10黑色素瘤負擔

建立OVA- DTH小鼠模型，以研究對照和SMRT KD cDC1 DCs的免疫調節。首先在小鼠耳后皮下用佐劑（明礬alum）乳化的OVA致敏；對照組和SMRT KD cDC1經OVA脈沖4h后經CpG活化2h后于第14天過繼轉移；第20天，DC過繼轉移一周后，小鼠左腳墊局部再次經OVA致敏刺激，以誘導超敏介導的炎癥反應；在OVA再次刺激后每12h至72h測量足墊腫脹，以檢查免疫反應的嚴重程度（圖5A）。結果顯示，與對照組cDC1和PBS處理的動物相比，CpG激活的SMRT KD cDC1處理的小鼠腳墊炎癥明顯增加（圖5B）。接下來，檢查腘窩淋巴結和腹股溝淋巴結中的T細胞亞型。與PBS處理組相比，注射SMRT KD DC的小鼠顯示出明顯增加的Th1亞型，表現為IFN-g和T-bet陽性T細胞數量（圖5C）。同時，注射SMRT KD cDC1的小鼠中Th17 T細胞數量也顯著增加表現為IL-17和RORgt陽性細胞（圖5D）。這些結果表明，DC中SMRT敲低會在宿主體內產生非常強烈的炎癥T細胞反應。

對SMRT KD cDC1增強細胞毒活性的觀察引導進一步研究這些細胞的抗腫瘤潛能。已廣泛報道DC疫苗治療誘導腫瘤相關抗原（TAA）特異性的溶瘤CD8+ T細胞活性。因此，為評估SMRT KD cDC1誘導的細胞毒性CD8 + T細胞增強的生理影響，在C57BL/6小鼠中建立了B16F10黑色素瘤模型。假設，與對照組相比，接種了載有B16抗原的炎性SMRT KD cDC1疫苗的動物能夠抵抗不斷增加的腫瘤負擔。首先，在動物左側皮下接種SMRT KD和對照細胞，這些細胞之前被B16F10細胞裂解液脈沖處理，以誘導對B16F10腫瘤的免疫。3天后，注射強化劑量。強化劑量7天后，在小鼠右側皮下注射106 B16F10細胞（圖5E）。從腫瘤發生后的第7天到第16天，每隔一天測量一次腫瘤體積。與對照組DC和PBS處理組相比，SMRT cDC1組的腫瘤負荷明顯減少（圖5F,G）。為進一步評估CD8+ T細胞的細胞毒性，在腫瘤發生后的第16天殺死小鼠，解剖腫瘤并通過膠原酶處理制成單細胞懸液。用PMA/Ionomycin/BFA刺激這些細胞5小時，用流式細胞儀分析CD8+ T-細胞。與對照組或PBS組相比，SMRT KD cDC1接種動物的效應T細胞的細胞毒性顯著增強，表現為perforin、GzB和IFN-g陽性群體的比率增加（圖5H）。此外，SMRT KD cDC1接種動物腫瘤的重量顯著減輕（圖5I）。

圖5過繼轉移Control和SMRT KD DC的C57BL/6小鼠的DTH反應和腫瘤消退

7、cDC1中NCoR1和SMRT的比較基因組和轉錄組分析顯示，STAT3信號介導的IL- 10調控存在差異

作者此前發現NCoR1直接結合并強烈抑制DC的耐受性基因，如Il10、Il27、Cd83和Socs3。NCoR1敲除急劇增加了這些基因的表達，從而導致耐受性基因的表達，進而導致了Treg的產生。與此相反，本研究發現，NCoR1同源物SMRT KD MutuDC在體外和體內顯著增加炎癥反應。因此，作者進行了NCoR1和SMRT的基因組比較，以及NCoR1和SMRT KD DCs的轉錄組分析，以了解NCoR1和SMRT的不同基因調節。

在CpG刺激6小時下，與對照組比較，SMRT KD cDC1的差異基因表達分析顯示，分別有1273和934個基因上調和下調（圖6A）。通過SMRT的ChIP-seq分析發現，與下調的基因相比，大量的SMRT結合基因被確定為上調，這支持了其作為輔抑制因子的作用（圖6B）。此外，在SMRT KD條件下，直接上調靶基因的IPA分析顯示炎癥反應途徑的上調，如IL-12信號通路（圖6C）。然而，與NCoR1相反，SMRT KD顯示IL-10信號通路在CpG刺激6h時下調（圖6D）。

為識別NCoR1和SMRT KD后表現出不同表達模式的基因集，對DEGs進行無監督K-means聚類，并確定了6個聚類（圖6E）。cluster-1中的基因在NCoR1和SMRT KD中均表現出成倍增加的變化，并參與豐富的通路，如“Interferon signaling”，“Activation of IRF by cytosolic pattern recognition receptors”，“IL-12 signaling and production in macrophages”。相反，cluster-2基因在SMRT和NCoR1 KD 6h CpG條件下表現出差異調控，富集的通路為“Th2 pathway”，“STAT3 pathway”，“IL-17-A signaling”和“IL-10 Signaling”（圖6F）。這些觀察結果清楚地表明，炎癥免疫反應基因如Il12b和Il6均被NCoR1和SMRT抑制，而調控基因如Il10、Socs3僅被NCoR1強烈抑制（圖6G）。

此外，NCoR1和SMRT峰的差異結合鑒定出NCoR1主導(12,473)、普通NCoR1-SMRT主導(5949)和SMRT主導(2707)基因組區域（圖6H, I）。與NCoR1顯性區和常見的NCoR1-SMRT結合區主要分布在內含子或遠端基因間區相比，SMRT主導區在啟動子-近端區域占優勢，（圖6H）。這進一步表明，SMRT主要通過啟動子-近端結合調控基因，而NCoR1和常見的NCoR1-SMRT結合基因則通過遠端調控元件調控。

此外，與基因組區域相關的基因KEGG通路分析顯示，NCoR1或常見NCoR1-SMRT結合的CpG依賴性增加主要富集“Th1 and Th2 pathway”，“Th-17 signaling pathway”，“NFkB signaling pathway”，“JAK-STAT signaling pathway”（圖6J）。CpG激活后，NCoR1和SMRT在TSS的幾個近端或遠端區域共同占據炎癥(Il12b)和耐受基因(Il10)，表明這兩種抑制因子都參與調節免疫反應基因（圖6K）。

為確定在這些輔抑制子結合的基因組區域在CpG激活6小時前后募集的轉錄因子，進行de novo基序富集分析，發現PU.1、RUNX2和Jun-Fos/AP1轉錄因子基序在幾乎所有NCoR1都富集，而SMRT結合的基因組區域在未受刺激或CpG激活6小時時富集。有趣的是，NFkB基序在CpG顯性NCoR1、顯性SMRT和普通NCoR1-SMRT結合位點被富集。在未受刺激和6h CpG激活條件下，IRF8和IRF4基序分別在顯性NCoR1和常見NCoR1- SMRT區域富集（圖6L）。

除上述基序外，還發現在CpG顯性NCoR1-SMRT和CpG顯性SMRT基因組區STAT3基序富集。由于NFkB家族成員和Stat3轉錄因子在調節炎癥(Il12b, Il6)和耐受(Il10, Socs3)基因表達中起著重要作用，為進一步了解耐受基因的下調，檢測了與Jak-Stat信號通路相關的其他基因的表達。發現其他幾種Jak-Stat信號的調控存在明顯差異，SMRT KD DC中Jak-Stat信號被下調而NCoR1 KD DC中無變化（圖7A, B）。總的來說，基因組和轉錄組比較分析表明，與NCoR1 KD DC相比，SMRT KD DC顯示STAT3-IL-10軸失調。

圖6整合基因組學分析（RNA-seq和ChIP-seq）鑒定SMRT和NCoR1在cDC1免疫應答調節中的差異作用

8、SMRT介導的NR4A1下調抑制mTOR-STAT3信號，導致IL-10抑制

STAT3 TF在Jak-Stat信號通路和調控Il10和Socs3的表達中起著核心作用。在SMRT KD cDC1中，NFkB抑制基因Nfkbia和Tnfaip3在CpG刺激6h后也被下調。首先，為確認NCoR1和SMRT中p-STAT3的差異調控，在CpG激活后0h、2h和6h對NCoR1 KD、SMRT KD和對照cDC1中的p-STAT3進行WB。結果顯示，與對照細胞相比，SMRT KD cDC1中p-STAT3表達下調，而在NCoR1 KD DC中p-STAT3表達上調（圖7C, D）。

據報道，STAT3結合Il10基因調控其表達。所以作者對p-STAT3進行染色質免疫沉淀(ChIP)，然后進行RT-qPCR，以推斷對照組、NCoR1 KD和SMRT KD cDC1在CpG處理2h后p-STAT3與Il10基因的結合情況。觀察到，相對于對照DC，SMRT KD DC中p-STAT3與Il10的結合減少，而另一方面，與對照DC相比，NCoR1 KD細胞中p-STAT3與Il10的結合增強（圖7E）。

此外，為了解這些DC中STAT3信號的上游控制，作者查閱了相關文獻，發現mTOR可控制STAT3激活，另一方面mTOR受核受體NR4A1（又叫Nur77）調控。首先檢測NCoR1和SMRT敲低cDC1中p-mTOR的調控，發現在NCoR1 KD cDC1中p-mTOR上調，而在SMRT敲低后p-mTOR急劇降低（圖7F,G）。此外，在SMRT和NCoR1缺失DC中Nr4a1 (Nur77)的差異調控。SMRT KD導致Nr4a1表達下調，而NCoR1 KD對Nr4a1表達無顯著影響（圖7H）。使用IGV檢測了ChIP-seq數據中NCoR1和SMRT在Nr4a1上的直接結合，觀察到在CpG激活6h后，SMRT而不是NCoR1結合TSS轉錄本（圖7H）。作者還通過評估在CpG激活2h和6h前后SMRT KD和對照cDC1中的NR4A1蛋白表達來證實這一結果：與對照細胞相比，SMRT KD DC中的NR4A1蛋白表達顯著下調（圖7I, J）。

為進一步證實NR4A1確實在SMRT KD細胞中通過mTOR控制STAT3信號，使用NR4A1慢病毒構建了穩定的NR4A1 KD和空載體cDC1細胞，以確認其在mTOR- STAT3 - IL-10信號中的作用。在NR4A1敲除效率通過WB證實（圖7K, L）。在CpG激活2h后檢測p-mTOR和p-STAT3，發現與對照細胞相比，NR4A1缺失的cDC1中p-mTOR和p-STAT3顯著減少（圖7K, L）。此外，在NR4A1缺失的cDC1中，CpG處理6h后IL-10陽性細胞顯著減少，相應的MFI也減少（圖7M）。此外，作者還嘗試在SMRT KD cDC1中短暫過表達NR4A1 ORF，但由于過表達質粒轉導后細胞狀態不佳，未能成功進行這一分析，因此，使用了另一種方法。報道稱6- MP可誘導細胞NR4A1的表達。因此，使用6-MP增強SMRT KD cDC1中Nr4a1的表達，看看它是否可以補充IL-10的表達。結果顯示6-MP處理增強SMRT KD cDC1中Nr4a1的表達，導致IL-10的表達增加（圖7N）。這些結果證實，SMRT KD介導的NR4A1下調導致STAT3激活減少，從而降低IL-10水平，增強cDC1的炎癥表型。

圖7 Nurr-77、mTOR、Stat3信號調節IL-10在SMRT - KD cDCs中的表達

參考文獻：

Jha A, Ahad A, Mishra GP, Sen K, Smita S, Minz AP, Biswas VK, Tripathy A, Senapati SB, Gupta B, Acha-Orbea H and Raghav SK (2022) SMRT and NCoR1 fine-tune inflammatory versus tolerogenic balance in dendritic cells by differentially regulating STAT3 signaling. Front. Immunol. 13:910705. doi: 10.3389/fimmu.2022.910705