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基于全轉錄組測序分析淋巴轉移相關circRNA-miRNA-mRNA網絡探索三陰性乳腺癌的發病機制和治療靶點

欄目:最新研究動態 發布時間:2023-01-16
對于TNBC患者,局部或區域復發、遠處轉移和死亡的風險在診斷后約2-3年達到高峰,TNBC似乎更可能轉移到內臟器官,如肝、肺和腦......


三陰性乳腺癌(TNBC)約占全球乳腺癌診斷總發病率的15%,預后相對不利。對于TNBC患者,局部或區域復發、遠處轉移和死亡的風險在診斷后約2-3年達到高峰,TNBC似乎更可能轉移到內臟器官,如肝、肺和腦。特別是,TNBC患者的腋窩淋巴結(ALNs)轉移是一個強有力的獨立預后因素,表明5年生存率較差。此外,與淋巴結陰性患者相比,微轉移淋巴結受累與死亡風險增加相關。然而,ALN轉移的潛在確切機制尚不清楚。該研究發表于《Journal of Translational Medicine》,IF: 8.44


技術路線:



主要研究結果:

首先,為了鑒定潛在的ALN轉移相關miRNAcircRNAmRNA,對三對ALN陽性和ALN陰性TNBC組織進行了全轉錄組測序(WTS)。作者總共鑒定了739mRNA206circRNA110miRNA,它們以熱圖的形式呈現(圖1)。


1 ALN陽性和ALN陰性TNBC患者之間差異表達RNA的熱圖


簡而言之,鑒定出206DEC,包括41個上調和165個下調的circRNA(圖2A)。共鑒定出110DEMi,其中53個上調miRNA57個下調miRNA(圖2B)。同時,在739DEM中,371mRNA過表達,368mRNA下調(圖2C)。


2 ALN陽性和ALN陰性TNBC患者之間差異表達RNA的火山圖


然后,對DEM進行了功能富集分析。通過clusterProfiler(版本3.14.3)進行KEGG通路分析以識別顯著富集的通路。具體而言,DEMs主要富集于TGF-β信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路、細胞周期、p53信號通路、乳腺癌、TNF信號通路、IL-17信號通路和河馬信號通路(圖3A)。此外,還進行了標志性基因分析,以使用clusterProfiler基于分子特征數據庫確定有意義的途徑。DEM主要參與E2F靶標、缺口信號傳導、血管生成、G2M檢查點、糖酵解、早期雌激素反應、晚期雌激素反應和IL2 STAT5信號傳導(圖3B)。在這些通路中,TNF信號通路、細胞周期、p53信號通路、乳腺癌和NOTCH信號通路與TNBC的致癌作用和進展有關。


3 DEM的功能富集分析


接下來,為了探索DEC和DEMis在TNBC的ceRNA網絡中的潛在重要作用,作者構建了一個circRNA-miRNA\u2012mRNA(ceRNA)網絡。首先,作者提取了從RNA-seq數據中選擇的八個排名靠前的DEC(hsa_circRNA_061260,hsa_circRNA_060876,hsa_circRNA_046265,hsa_circRNA_087060,hsa_circRNA_007336,hsa_circRNA_007333,hsa_circRNA_044837和hsa_circRNA_000150)相關的數據。然后,作者使用circBank和CircInteractome在線數據集篩選了八個DEC靶向的潛在miRNA,并將它們與已鑒定的DEMi重疊。結果,產生了由8個DEC和6個DEMi(has-miR-1207-5p,has-miR-4763-3p,has-miR-326,has-miR-885-3p,has-miR-5000-3p和has-miR-4792)組成的circRNA-miRNA網絡。隨后,利用miRTarBase和TargetScan來識別這6個DEMi靶向的mRNA。接下來,將靶向mRNA與先前確定的DEM進行交叉檢查,并識別出18個DEM。最后,作者使用Cytoscape 3.7.1在TNBC中建立了一個包含8個DECs,6個DEMi和18個DEMs的ceRNA調控網絡(圖4)。


4 TNBCcircRNA-miRNA-mRNAALN轉移相關ceRNA網絡


下一步是對相關的DEM進行生存分析。為了研究DEMs的表達及其在BC中的預后價值,作者從Kaplan\u2012Meier Plotter數據庫中檢索了臨床樣品的mRNA表達譜數據以及相應的總生存期(OS)和無復發生存期(RFS)數據。然后,對來自ceRNA網絡的18個DEM進行存活分析。RAB3D和EDARADD與OS顯著相關,GSR與BC患者的RFS顯著相關(圖5)。RAB3D和EDARADD的高表達水平預示著更好的OS。同時,GSR的高表達水平預示著更好的RFS。因此,這3種mRNA及其對應的基因最有可能成為通過TNBC中ceRNA網絡調控DEC的靶基因。


5 ceRNA網絡中生存相關差異表達的mRNAKaplan\u2012Meier曲線


根據生存相關DEM的結果,作者確定了與生存結果相關的相應基因。三個已鑒定的基因(RAB3D,EDARADD和GSR)可能是TNBC預后的重要生物標志物。然后,作者基于這些th-ree基因構建了一個與生存相關的ceRNA網絡。如圖6所示,鑒定了包含兩個DEC(hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876)、兩個DEMIS(has-miR-5000-3p 和 has-miR-4792)和三個 mRNA(GSR、RAB3D 和 EDARADD)的三個ceRNA調控軸。來自生存相關ceRNA網絡的這些調節模塊包括hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / GSR調控軸、hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / RAB3D調控軸和hsa_circRNA_061260 / hsa-miR-5000-3p / EDARADD調控軸。


6 TNBC中與生存相關的circRNA-miRNA\uu2012mRNA調控網絡


最后,為了驗證TNBC細胞中可能失調的候選DEC的結果,作者首先在以下細胞系中進行RT\u2012qPCR:MCF-10 A,MDA-MB-231和MDA-MB-453。作者選擇了兩個DEC進行進一步分析,并進行了Sanger測序,以確認這兩個DEC獨特的反向拼接連接位點(圖7A-B)。DEC hsa_circRNA_061260位于chr21:11,047,480–11,049,621,由外顯子4和外顯子5組成。DEC hsa_circRNA_060876位于chr20:50,226,639–50,292,747,由外顯子10至24組成。PCR結果顯示,與MCF-10 A細胞系相比,MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞系中hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876的表達水平均下調(p <0.01; 圖7C-D)。


7 有關circRNA及其反向拼接連接位點的詳細信息


結論:

該研究利用WTS研究了TNBC中ALN轉移的分子機制。建立了生存相關的ceRNA網絡,確定了兩種新型DEC作為TNBC中ALN轉移的可能預后預測因子和潛在治療靶點。這些發現為闡明TNBCALN轉移的機制、實現早期診斷和確定治療靶點提供了新的思路。


參考文獻:

Luo J, Cao D, Hu C, Liang Z, Zhang Y, Lai J. Lymphatic metastasis-associated circRNA?miRNA?mRNA network for exploring the pathogenesis and therapeutic target of triple negative breast cancer based on whole-transcriptome sequencing analysis: an experimental verification study. J Transl Med. 2022 Nov 5;20(1):508. doi: 10.1186/s12967-022-03728-6.