后縱韌帶骨化(OPLL)是一種致殘性疾病，其發病機制尚不清楚，尚無有效的治療或預防方法。外泌體miRNA在異位骨的成骨過程中起著重要作用。最近，有作者關注miR-140-5p在OPLL細胞來源外泌體中的下調，因此以探索外泌體miR-140-5p抑制OPLL成骨的機制。該研究于2022年10月發表在《Journal of Nanobiotechnology》，IF：9.249.

技術路線：

主要研究結果：

1. MiR-140-5p在來自OPLL細胞的外泌體中顯著下調

作者在手術過程中收集OPLL患者的組織樣本，利用靠近骨化塊的韌帶體外培養細胞，并在后縱韌帶細胞培養上清中收集外泌體。以從頸椎外傷(non-OPLL)患者的后縱韌帶(PLL)細胞培養上清中獲得外泌體作為對照組。在透射電鏡下觀察到典型的外泌體雙層膜結構(圖1a)。納米顆粒跟蹤分析(NTA)顯示各組收集到的胞外囊泡大小約為108 nm至120 nm(圖1b)。檢測到外泌體標記CD63和TSG101(圖1c)。隨后，使用下一代測序(NGS)技術分析外泌體中差異表達的miRNAs(圖1d)。用PCR檢測前三種下調的miRNA以驗證NGS數據，結果顯示miR-140-5p在OPLL細胞來源的外泌體中顯著下調(圖1e)。

圖1 MiR-140-5p在來自OPLL細胞的外泌體中顯著下調

2. 外泌體miR-140-5p從OPLL細胞傳遞到hMSCs

為了闡明miR-140-5p是否由OPLL細胞分泌并傳遞到hMSCs，用慢病毒(LV-miR-140-5p)或其陰性對照轉染OPLL細胞，使miR-140-5p過表達(圖2a)，然后收集細胞培養上清分離外泌體。qPCR顯示miR-140-5p在外泌體中富集(圖2b)。用PKH67標記過表達miR-140-5p的外泌體，然后將其添加到hMSC培養中。在hMSCs的細胞質中PKH67熒光呈陽性(圖2c)，表明miR-140-5p通過外泌體傳遞到hMSCs中。此外，在用過表達miR-140-5p的外泌體和對照外泌體培養的hMSCs中，分析miR-140-5p的前體miR-140的表達水平(圖2d)，均無顯著差異。這些結果表明，miR-140-5p在hMSCs中的上調是由外泌體傳遞而非內源性miR-140轉錄誘導的。

圖2外泌體miR-140-5p從后縱韌帶細胞傳遞到hMSCs

3. MiR-140-5p抑制hMSCs成骨分化

形成異位骨化的前提是hMSCs開始成骨分化。因此，為了闡明外泌體miR-140-5p在OPLL發病機制中的作用，研究外泌體miR-140-5p對hMSCs成骨分化的影響。用慢病毒LV-miR-140-5p或LV-sponge分別轉染OPLL細胞(圖3a)，使miR-140-5p過表達或下調；同時轉染陰性對照慢病毒LV-miR-NC或LV-sponge-NC。隨后，收集細胞條件培養基分離以下外泌體：miR-140-5p-exo, miR-NC-exo, sponge-exo和sponge-NC-exo。qPCR證實miR-140-5p在外泌體中成功過表達或下調(圖3b)。hMSC與上述外泌體培養24 h后，qPCR顯示miR-140-5p-exo處理后，miR-140-5p在hMSCs中的表達上調(圖3c)，說明miR-140-5p通過外泌體傳遞到hMSCs中。隨后使用成骨誘導培養基誘導hMSCs成骨分化。7天后，用alkaline phosphatase對hMSCs進行染色。14 d后，用Alizarin red染色hMSCs。結果顯示，miR-140-5p-exo處理后hMSC染色陽性率明顯低于其他各組(圖3d，e)。qPCR和Western blotting顯示，在miR-140-5p-exo處理的hMSCs中，成骨相關基因的表達被顯著抑制(圖3f，g)。綜上所述，這些結果表明外泌體miR-140-5p抑制了hMSCs的成骨分化。外泌體中miR-140-5p的缺失可促進hMSCs成骨分化和成骨相關基因的表達。

圖3 MiR-140-5p抑制hMSCs成骨分化

4. 胰島素樣生長因子1 (IGF1R)是miR-140-5p的直接靶標

為了闡明miR-140-5p抑制hMSCs成骨分化的機制，使用TargetScan數據庫預測了miR-140-5p的靶基因，發現了434個轉錄本。使用miRDB數據庫預測靶點，miRDB中有413個miR-140-5p預測靶點。為了縮小可能的候選基因范圍，我們測定了上述兩個數據庫的重疊，共顯示191個基因(圖4a)。其中一種是IGF1R，它屬于受體酪氨酸激酶家族。我們檢測了miR-140-5p-exo處理后hMSCs中IGF1R的mRNA水平，結果顯示IGF1R的mRNA水平明顯降低(圖4b)。熒光素酶報告實驗證明IGF1R與miR-140-5p能直接結合(圖4c，d)。此外， miR-140-5p mimic下調了hMSCs中IGF1R mRNA和IGF1R蛋白(圖4e, f)。綜上所述，這些結果表明IGF1R是miR-140-5p的直接靶標。外泌體miR-140-5p與IGF1R 3'UTR相互作用，并在hMSCs中發揮轉錄抑制作用。

圖4 IGF1R是miR-140-5p的直接靶標

5. 來源于OPLL細胞的外泌體miR-140-5p靶向IGF1R并調節mTOR通路

為了闡明外泌體miR-140-5p對hMSCs成骨分化的抑制作用是通過抑制IGF1R介導的，使用IGF1R siRNA直接敲除hMSCs中的IGF1R(圖5a)。hMSCs成骨誘導后，敲低組hMSCs alkaline phosphatase和Alizarin red染色陽性率明顯低于對照組(圖5b, c)。OCN、COLIA1、RUNX2和ALP的表達也被抑制(圖5d，e)。IGF1R拯救實驗表明，上調IGF1R后，alkaline phosphatase和Alizarin red染色呈強陽性，OCN、COLIA1、RUNX2、ALP表達水平也升高(圖5f-j)。此外，在用LV-IGF1R轉染hMSCs后，用miR-140-5p-exo處理，IGF1R促進成骨的作用被逆轉(圖5k, l)。

圖5 IGF1R對于外泌體miR-140-5p抑制hMSCs成骨至關重要

有文獻報道IGF1和IGF1R聯合使用可以通過激活mTOR通路促進MSCs成骨，從而改善小鼠骨質疏松癥。在用miR-140-5p-exo處理hMSCs后，IGF1不刺激IGF1R、IRS1、PI3K、Akt或mTOR的磷酸化，而在miR-NC-exo、sponge-exo或sponge-NC-exo處理后，IGF1刺激IGF1R、IRS1、PI3K、Akt和mTOR的磷酸化(圖6a)。為了闡明IRS1、PI3K、Akt和mTOR的上下行關系，用IRS1抑制劑NT157處理hMSCs。結果表明，IGF1不能引起PI3K、Akt、mTOR的磷酸化。LY294002 (PI3K抑制劑)治療可降低IGF1引起的Akt和mTOR磷酸化，但不影響IGF1R和IRS1的磷酸化。此外，MHY1485 (mTOR抑制劑)治療不能抑制IGF1引起的IRS1、PI3K或Akt的磷酸化(圖6b)。因此，上述關鍵分子的上下行關系為IGF1R/IRS1/PI3K/Akt/mTOR。為了進一步闡明IGF1R/IRS1/PI3K/Akt/mTOR軸的作用，分別使用NT157 (IRS1抑制劑)、LY294002 (PI3K抑制劑)、MK2206 (Akt抑制劑)和MHY1485 (mTOR抑制劑)干擾hMSCs的成骨誘導。結果顯示NT157、LY294002、MK2206、MHY1485分別抑制hMSCs的成骨分化(圖6c, d)。綜上所述，這些數據表明外泌體miR-140-5p通過靶向IGF1R和調節mTOR途徑抑制hMSCs的成骨分化。

圖6外泌體miR-140-5p通過IGF1R/IRS1/PI3K/Akt軸調控mTOR通路抑制成骨

6. MiR-140-5p在體內抑制骨形成

為了進一步探索miR-140-5p在體內的功能，在裸鼠中進行了異位骨形成實驗。用miR-140-5p-exo、miR-NC-exo、sponge-exo或sponge-NC-exo培養hMSCs 48 h。成骨誘導后，將上述hMSCs與Bio-Oss Collagen充分混合并培養48 h。最后，將支架和細胞的混合物植入裸鼠背部皮膚下(圖7a)。8周后處死動物，通過顯微計算機斷層掃描計算骨體積/組織體積(BV/TV)和骨密度(BMD)(圖7b)。結果顯示，miR-140-5p-exo處理后，異位骨BV/TV和BMD顯著降低(圖7c和d)。隨后，對異位骨進行免疫組化檢測，結果顯示miR-140-5p-exo處理后，異位骨中OCN、COLIA1、RUNX2、ALP的表達均被抑制，而對照組均為陽性(圖7e)。此外，還對異位骨切片進行IGF1R免疫染色，結果顯示，miR-140-5p-exo處理的異位骨中IGF1R陽性率明顯低于對照組(圖7e)。上述結果表明，miR-140-5p在體內對骨形成具有抑制作用。

綜上所述，外泌體miR-140-5p在PLL細胞中的表達明顯低于PLL細胞。MiR-140-5p通過外泌體轉入hMSCs，靶向IGF1R，調控IRS1/PI3K/Akt，最終通過mTOR途徑抑制成骨分化（圖7f）。在OPLL細胞中過表達miR-140-5p可抑制hMSCs的成骨分化，這是一種潛在的治療OPLL的新策略。

圖7 MiR-140-5p在體內抑制骨形成

結論：

外泌體miR-140-5p可以通過靶向IGF1R和調節mTOR途徑抑制hMSCs的成骨分化。外泌體作為一種藥物傳遞系統，可能在未來成為治療OPLL的潛在藥物治療手段。IGF1B也可能是未來OPLL分子治療的靶點。

參考文獻：

Tang Y, Sun Y, Zeng J, Yuan B, Zhao Y, Geng X, Jia L, Zhou S, Chen X. Exosomal miR-140-5p inhibits osteogenesis by targeting IGF1R and regulating the mTOR pathway in ossification of the posterior longitudinal ligament. J Nanobiotechnology. 2022;20(1):452.