最近的研究表明，癌細胞除了消耗葡萄糖，可能還偏向腫瘤微環境中特定的能源物質。然而，相關機制尚不清楚。本研究強調靶向CAF特異性lncRNA以抑制谷氨酰胺流入和逆轉LUAD的腫瘤活性的治療潛力。LINC01614可能是LUAD的潛在生物標志物和治療靶標。本研究于2022年10月發表于期刊《J Hematol Oncol》（IF：23.168）。

技術路線：

主要研究結果：

1、來自CAFs的外泌體包裝RNA增強谷氨酰胺的攝取和LUAD細胞進展

作者首先驗證了CAFs（癌癥相關成纖維細胞）在LUAD（肺腺癌）中的作用。在LUAD的組織微陣列（TMA）中通過α-SMA免疫組織化學（IHC）染色鑒定活化成纖維細胞的數量（圖S1A）。與正常肺組織相比，α-SMA在LUAD中高度過表達（圖S1B）。α-SMA + CAF密度與T階段呈正相關（圖S1C）。α-SMA的高表達與較差的總生存期相關（圖S1D）。使用原代CAF和來自人LUAD樣品的配對正常成纖維細胞(NFs)進行體外功能實驗（圖S1E-F）。作者建立共培養Transwell系統后，發現與CAFs共培養的LUAD細胞系（谷氨酰胺敏感的A549和谷氨酰胺不敏感的H1975）比單獨培養或與NFs共培養的LUAD細胞系表現出更高的增殖，遷移和入侵能力（圖S1G-I）。

為鑒定CAF介導的LUAD進展的分子機制，作者進行了RNA-seq分析，轉錄組的反應體途徑分析和基因集富集分析（GSEA）顯示，在與CAFs共培養的A549細胞中，參與氨基酸和衍生物代謝的基因顯著上調（圖1A，B）。然后作者分別檢測在單獨培養的A549和與NFs和CAFs共培養的A549中線粒體耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)，線粒體活性和糖酵解的量度的變化，發現與CAFs共培養的LUAD細胞表現出更高的線粒體OCR和ATP合成（圖1C，D）。此外，作者通過代謝組學研究鑒定用指定外泌體處理的A549條件培養基中差異表達代謝物（圖1E）。隨后發現CAF衍生的外泌體顯著增強了線粒體OCR、谷氨酰胺消耗率、谷氨酰胺流入、ATP合成，來自谷氨酰胺分解代謝的TCA中間體的豐度以及LUAD細胞的增殖、遷移和侵襲（圖1F-K）。更重要的是，使用anti-CD31抗體消耗CAFs CM中的外泌體顯著抑制它們在促進谷氨酰胺代謝和LUAD細胞增殖、遷移和侵襲中的作用（圖1F-K）。這些結果表明，CAF衍生的外泌體增強了谷氨酰胺的流入并促進了LUAD細胞的發展。另外，作者觀察預處理的外泌體與RNase和Triton-X-100消除了CAFs對LUAD細胞的影響（圖1L-N）。這些數據證實來自CAFs的部分外泌體包裝RNA有助于增強谷氨酰胺代謝LUAD。

圖S1 CAFs促進LUAD進展，增強LUAD細胞的谷氨酰胺代謝

圖1來自CAFs的外泌體包裝RNA增強LUAD細胞中谷氨酰胺的攝取和進展

2、特定于CAF的lncRNA LINC01614的驗證和轉移

為了證明CAF特異性lncRNA是否介導LUAD細胞的谷氨酰胺addicting，作者根據NJLCC隊列篩選了CAF特異性lncRNA。作者檢查了TCGA數據及其在外泌體中的存在，共納入149例非小細胞肺癌患者。為篩選CAF相關的lncRNA，首先進行了一項分析，以基于TCGA LUAD數據集鑒定LUAD組織中過表達的lncRNA。發現649個lncRNA在LUAD組織中被上調(圖2A)。此外，作者基于NJLCC隊列和TCGA LUAD數據集確定195個lncRNA與TME群體的相關性。在195個與TME相關的lncRNA中，20個lncRNA與20種類型的LUAD基質細胞高度正相關，包括兩種與CAFs高度正相關的lncRNA（LINC01614(ENSG000000230838和ENSG00000261327）（圖2B）。

qRT-PCR實驗發現，與LUAD細胞系、MRC5細胞（人胚肺成纖維細胞）和paired NFs相比，LINC01614而不是ENSG00000261327在CAFs中高表達（圖2C）。然后，作者通過熒光激活細胞分選（FACS）從LUAD組織中分離出CAFs，并且LINC01614而不是ENSG00000261327主要在CAFs中表達，而不在非CAF細胞中表達（圖2D）。鑒于CAF exosomal RNA增強了谷氨酰胺流入和LUAD的進展，作者調查了LINC01614是否可以從CAFs中以外泌體的方式釋放。在RNase處理后，CAF CM中LINC01614的表達沒有改變，但是當與RNase和Triton-X-100共孵育時LINC01614的表達顯著降低（圖2E），這表明LINC01614可以從CAF釋放，并且細胞外LINC01614主要被膜包裹而不是直接釋放。此外，與NFs相比，CAFs外泌體中LINC01614增加了五倍以上，在與CAF衍生的外泌體共培養的A549細胞中增加了三倍以上（圖2F）。qRT-PCR結果表明，與炎性CAF (iCAF) 和antigen-presenting CAF (apCAF)相比，LINC01614在肌成纖維細胞 (myCAF) 中過表達。

為確認與CAF共培養的A549細胞中LINC01614的增加是否由外來體傳播引起，作者在共培養前分別敲除了CAFs中外切體分泌的關鍵酶LINC01614和RAB27，以消除LINC01614的釋放和外切體分泌（圖2G）。抑制外泌體分泌也抑制了與CAFs共培養的A549細胞中LINC01614的上調（圖2G）。重要的是，CAFs中的沉默LINC01614降低CAF外泌體中LINC01614的水平，而過表達LINC01614增加了CAF外泌體中的LINC01614水平（圖2G）。

此外，熒光原位雜交 (FISH) 和免疫熒光 (IF) 分析表明LINC01614在CAFs中過表達，并通過LUAD組織的α-SMA IF staining確定LINC01614的表達與CAF浸潤密度呈正相關（圖2H）。為進一步確認CAF衍生的LINC01614是否伴隨外泌體轉移，在與熒光標記的A549細胞共培養之前，作者用5-ethynyl uridine (EU) 標記CAF RNA。通過EU-modification with azide-linked fluorescein 評估，24小時后，A549細胞獲得CAF RNA（圖2I）。此外，當CAF類似地用4-thiouridine (4sU) 標記時，CAF CM處理導致LINC01614從CAFs轉移到A549細胞。相反，當使用exosome inhibitor GW4869，外泌體從CM中耗盡時，LINC01614沒有轉移到A549細胞（圖2J）。這些數據表明CAF特異性lncRNA-LINC01614可以被釋放，并通過外泌體從CAFs轉移到LUAD細胞。

圖2 外泌體在CAF特異性lncRNA LINC01614細胞間的轉移

3、CAF-exosome packed LINC01614是一種致癌lncRNA，通過上調氨基酸轉運蛋白來增強LUAD細胞的谷氨酰胺攝取

敲低shLINC01614沉默CAFs中LINC01614，或擊倒RAB27抑制外泌體分泌都可以消除CAF誘導的LUAD細胞中谷氨酰胺的流入和利用（圖3A，B）。異位LINC01614表達增強了LUAD細胞中谷氨酰胺的利用（圖3C，D）。當處理LUAD細胞時，來自LINC01614-silencing CAFs的外泌體抑制了細胞增殖、遷移和侵襲，而來自CAFs的外泌體LINC01614異位表達促進這些能力（圖3E，F）。此外，異位表達LINC01614還顯著促進了LUAD細胞的惡化表現（圖3G，H）。接下來，作者研究了LINC01614對LUAD細胞進展的相關作用是否與癌細胞的特異性谷氨酰胺addicting有關。結果表明，隨著補充的谷氨酰胺濃度的增加，A549和H1975細胞對谷氨酰胺的addicting日益增加。異位LINC01614的表達增強了LUAD細胞的增殖，遷移和侵襲行為，但是當谷氨酰胺被剝奪時，未能增強LUAD細胞的惡性行為（圖3I，K）。總的來說，這些數據進一步證實了LINC01614促進了對谷氨酰胺特異性上癮的LUAD細胞進行的惡性進展。沉默LINC01614減弱了SLC38A2和SLC7A5，而過表達LINC01614增強了CAF外泌體處理的A549細胞中的表達（圖3L，M）。此外，A549細胞中異位LINC01614的表達增強了SLC38A2和SLC7A5的表達（圖3N）。這些數據表明，CAFs通過外泌體傳遞CAF特異性lncRNA-LINC01614，增強了谷氨酰胺的流入和利用以及LUAD細胞的惡化表現。

圖3 CAF-exosome packed LINC01614通過上調氨基酸轉運蛋白來增強LUAD細胞的谷氨酰胺攝取

4、LINC01614增強了ANXA2和p65的相互作用，促進NF - κB的激活

FISH assays驗證LINC01614主要分布在CAF細胞質中。Immunoblotting和RNA immunoprecipitation (RIP) assays證實p65 (Rela)和Annexin A2 (ANXA2)與LINC01614相關（圖4A，C）。此外，LINC01614與ANXA2可與p65共免疫沉淀（圖4D），提示LINC0164、ANXA2和p65可形成一個三元絡合物。LINC01614的加入，而不是反義的lncRNA，能有效地增強了p65和ANXA2之間的相互作用（圖4E）。為進一步研究LINC01614與p65和ANXA2相關聯的片段，作者生成了一系列LINC01614的截短片段。RTCA和Boyden chamber實驗發現LINC01614的973-1775 nt與p65和ANXA2相互作用（圖4F）。此外，一個缺乏LINC01614莖環結構的核苷酸突變減弱了p65和ANXA2之間的相互作用（圖4G）。更重要的是，將LINC01614973-1775引入到含有重組p65和ANXA2的孵育系統中它們的相互作用增強了（圖4H）。

為闡明LINC01614介導的谷氨酰胺內流的機制，作者對CAF外泌體處理的A549細胞的mRNA微陣列數據進行了GSEA分析。一組核因子kappa B (NF-κB) 靶基因，IL-6、CCL5和CXCL10與CAF-exosome-treated A549細胞中LINC01614顯著共表達（圖4I），同樣，在用CAF外泌體處理的A549細胞中觀察到上調的NF-κb轉錄活性和增加的p65核易位，而在CAFs中敲除LINC01614未能激活NF-κb轉錄和p65核易位（圖4J-L）。此外，LINC01614的異位表達增加了A549細胞中的NF-κb轉錄活性和p65核易位（圖4M，O）。總之，這些結果表明CAF衍生的LINC01614增強了p65和ANXA2的相互作用并促進了NF-κb的激活。

圖4 LINC01614增強了ANXA2和p65的相互作用，促進NF - κB的激活

5、LINC01614促進ANXA2依賴性p65磷酸化以及SLC38A2和SLC7A5的轉錄

為研究LINC01614激活NF-κb途徑的機制，作者評估了LINC01614對I κ Bα和IκB激酶（IKK）磷酸化的影響。然而，IKK和IκBα的磷酸化在A549細胞中不受異位LINC01614表達或CAF外泌體處理的影響（圖5A，B）。一致地，抑制NF-κB核易位 (JSH-23) 或沉默p65但不抑制IKK (BAY 11-7082)可以消除LINC01614對p65核易位的影響（圖5C）。從sh-LINC01614轉導的CAF提取的外泌體減弱了Ser276處p65磷酸化的增強（圖5D）。此外，A549細胞中的LINC01614或ANXA2過表達顯著增強了Ser276處p65磷酸化（圖5E）。蛋白質印跡、免疫熒光染色和熒光素酶報告基因分析所揭示，沉默ANXA2減弱了LINC01614誘導的Ser276 p65磷酸化、p65的核保留和A549細胞中的NF-κ B活化（圖5F-H）。有趣的是，沉默p65降低了A549細胞中SLC38A2和SLC7A5的表達（圖5I）。作者接下來評估了NF-κB激活是否促進了SCL38A2和SLC7A5的轉錄。JASPAR的序列分析表明，在SCL38A2和SLC7A5的啟動子上，NF-κB有典型的結合序列（圖5J）。重要的是，免疫沉淀(ChIP)分析和熒光素酶報告基因測定，分別確認了SLC38A2和SLC7A5啟動子上的NF-κB結合位點。此外，編碼的芯片測序數據證實了基因組位置SLC38A2和SLC7A5啟動子上p65的峰（圖5M）。這些數據表明，CAF衍生的LINC01614與p65和ANXA2相互作用，并促進Ser276處p65的ANXA2-induced磷酸化，從而導致LUAD細胞中兩個谷氨酰胺轉運蛋白SLC38A2和SLC7A5的轉錄的NF-κB活化。

圖5 LINC01614促進了依賴于ANXA2的p65磷酸化和SLC38A2和SLC7A5的轉錄

6、CAF-衍生的LINC01614在體內促進LUAD腫瘤發生，是潛在的治療靶標

異種移植腫瘤模型顯示，腫瘤內注射CAF外泌體或共注射CAFs可促進肺癌生長（圖6A，D）。來自shLINC01614轉導的CAFs的外泌體抑制了異種移植物中的腫瘤生長，伴隨著Ki67，SLC38A2和SLC7A5的表達降低（圖6E）。此外，CAF外泌體治療促進NCG(NODprkdc?/?IL-2Rg?/?)小鼠中LUAD細胞的肺轉移，通過沉默CAFs中的LINC01614部分逆轉其轉移（圖6F）。此外，CAFs在斑馬魚體內也表現出轉移能力（圖6G-J）。然而，在共注射或外泌體提取前，在CAFs中沉默LINC01614會減弱轉移性癌細胞和CAFs的數量（圖6G-J）。

圖6 CAFs在外泌體中釋放LINC01614增強谷氨酰胺吸收和LUAD在體內的進展

7、LINC01614與谷氨酰胺轉運蛋白和LUAD患者生存率差相關

為證實本研究發現是否與臨床相關，作者在包含78對LUAD和鄰近正常組織的TMA中對α-SMA進行免疫染色，分析了LINC01614表達與CAF浸潤的相關性，觀察到LINC01614在CAFs中大量表達。更重要的是，在78例具有豐富CAF浸潤的LUAD患者中，有37例在腫瘤細胞中顯示出增強的LINC01614雜交信號（圖7A）。腫瘤中LINC01614的CISH評分與CAF的密度呈正相關（圖7B）。LINC01614過表達與TNM隊列中T stage和TNM stage相關（圖7C，D）。Kaplan-Meier生存分析顯示，LINC01614的高表達與LUAD患者的不良總生存期相關（圖7E）。Cox比例風險模型表明LINC01614是LUAD的獨立預后因素（圖7F）。

此外，作者對10例LUAD患者進行SLC38A2、SLC7A5免疫染色，以α-SMA免疫染色表示CAF浸潤，將LINC01614的表達與腫瘤谷氨酰胺轉運蛋白相關聯。LINC01614在CAFs中富集，并且腫瘤細胞的LINC01614表達與α-SMA CAFs的密度以及腫瘤中SLC38A2和SLC7A5的表達呈正相關（圖7G）。此外，原代CAF中LINC01614的水平與配對的LUAD腫瘤細胞中SLC38A2和SLC7A5的mRNA水平呈正相關（圖7H，I）。這些臨床數據與實驗發現一致，即LINC01614從CAFs傳遞到LUAD細胞，從而增強LUAD中谷氨酰胺的攝取。

圖7 LINC01614與谷氨酰胺轉運蛋白和LUAD患者生存率差相關

結論

綜上所述，本研究發現CAFs通過上調LUAD中的氨基酸轉運蛋白而優先促進癌細胞對谷氨酰胺的成癮。本研究證明了LINC01614通過外泌體從CAFs釋放到LUAD細胞。在機制上，LINC01614直接與LUAD細胞中的ANXA2和p65相互作用，LINC01614是促進NF-κB磷酸化和活化的支架。值得注意的是，NF-κB激活不是IKK和IκB磷酸化的結果，而是依賴于p65的翻譯后修飾。

參考文獻

Liu T, Han C, Fang P, Ma Z, Wang X, Chen H, Wang S, Meng F, Wang C, Zhang E, Dong G, Zhu H, Yin W, Wang J, Zuo X, Qiu M, Wang J, Qian X, Shen H, Xu L, Hu Z, Yin R (2022) Cancer-associated fibroblast-specific lncRNA LINC01614 enhances glutamine uptake in lung adenocarcinoma. J Hematol Oncol. 15(1):141. doi: 10.1186/s13045-022-01359-4.