線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所。磷脂酶D2（PLD2）通過其酶活性調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。然而，PLD2在肥胖和2型糖尿病中的作用此前沒有被研究過。本研究強(qiáng)調(diào)靶向脂肪細(xì)胞中的PLD2，通過提升線粒體的質(zhì)量和數(shù)量增強(qiáng)生熱程序，解決飲食誘導(dǎo)的產(chǎn)熱缺陷。本研究于2022年2月發(fā)表于《J Exp Med》IF=17.579期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、脂肪細(xì)胞中PLD2與UCP1呈負(fù)相關(guān)

作者首先檢測PLD亞型在不同脂肪組織中的表達(dá)，調(diào)查PLD在脂肪組織中的作用。腹股溝白色脂肪組織（ingWAT）和棕色脂肪組織（BAT）中PLD1和PLD2 mRNA水平高于附睪白色脂肪組織（epiWAT）中PLD1和PLD2 mRNA水平（圖1）。作者接著探究在急性膳食誘導(dǎo)的生熱和肥胖中PLD亞型的表達(dá)的改變。有趣的是，長時(shí)間高脂肪飲食（HFD）喂養(yǎng)的小鼠BAT中UCP1（解偶聯(lián)蛋白1）和PLD2水平成負(fù)相關(guān)（圖1B）。然而，PLD1在蛋白水平上沒有檢測到，（圖1B）。類似地，在熱中性條件下（30℃）解除熱應(yīng)激的小鼠中，HFD喂養(yǎng)四周后，BAT中UCP1水平增加，但PLD2水平減少（圖1C）。

膳食誘導(dǎo)的生熱被認(rèn)為是由交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）及隨后β腎上腺素能受體（βARs）介導(dǎo)的。因此，作者研究SNS和βARs的刺激是否足以壓制PLD2水平。寒冷暴露（SNS和βAR激活）或β3AR興奮劑CL316, 243（CL）處理在室溫和熱中性下均顯著降低PLD2的表達(dá)，再次顯示出與BAT和ingWAT中UCP1水平的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖1D，E）。正如預(yù)想的一樣，SNS和βARs的激活也降低PLD活性（圖1F）。

作者發(fā)現(xiàn)熱中性條件下4周的HFD增加BAT和ingWAT中的蛋白酶體活性（圖1G）。β3AR拮抗劑SR59230A或蛋白酶體抑制劑硼替佐米，而不是溶酶體抑制劑氯喹，逆轉(zhuǎn)了βAR興奮劑異丙腎上腺素誘導(dǎo)的原代棕色脂肪細(xì)胞中PLD2的減少（圖1H和I）。這表明在飲食誘導(dǎo)的產(chǎn)熱過程中蛋白酶體活性的增加可能會(huì)誘導(dǎo)PLD2降解。然而，HFD喂養(yǎng)12周逆轉(zhuǎn)了蛋白酶體活性的增加（圖1J），與HFD喂養(yǎng)4周相比，HFD喂養(yǎng)12周小鼠UCP1水平的逆轉(zhuǎn)一致（圖1B）。上述所有結(jié)論表明在適應(yīng)性產(chǎn)熱過程中觀察到PLD2降解；然而，蛋白酶體活性的鈍化和長期HFD喂養(yǎng)后PLD2的補(bǔ)償性增加可能是PLD2在脂肪組織中的表達(dá)增加的原因。

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)在適應(yīng)性產(chǎn)熱過程中，PLD2在BAT上降解。異丙腎上腺素誘導(dǎo)的PLD2減少被硼替佐米阻斷，但氯喹不阻斷（圖1I），這表明βAR興奮劑刺激的PLD2減少是由棕色脂肪細(xì)胞中的蛋白酶體途徑介導(dǎo)的。此外，異丙腎上腺素誘導(dǎo)的PLD2降解被SR59230A阻斷（圖1H），提示β3AR在這一過程中起關(guān)鍵作用。這些結(jié)果表明適應(yīng)性產(chǎn)熱過程中β3AR的激活可能通過蛋白酶體途徑導(dǎo)致PLD2的降解。

圖1 HFD喂養(yǎng)后脂肪組織中PLD2的表達(dá)與UCP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

2、PLD2調(diào)節(jié)脂肪組織中的生熱程序

基于PLD2和UCP1水平的負(fù)相關(guān)關(guān)系，作者詢問PLD2是否抑制脂肪組織中的生熱程序。在PLD2 Ad-KO小鼠中，與對照窩鼠相比，ingWAT和BAT呈現(xiàn)更深的紅色（棕色）和更高的線粒體和產(chǎn)熱程序基因誘導(dǎo)（圖2A，B），這也得到H&E和UCP1組織染色的支持（圖2C）。PLD2 Ad - KO小鼠在BAT中表現(xiàn)出更高的溫度，并在4小時(shí)冷暴露中保持更高的直腸溫度（圖2D，E），這支持了PLD2在產(chǎn)熱程序中的作用。此外，注射PLD2特異性抑制劑CAY10594 7天的小鼠也產(chǎn)生與PLD2 Ad - KO小鼠相似的產(chǎn)熱棕色和米色脂肪（圖2F-H），提示PLD2酶活性參與脂肪組織的產(chǎn)熱激活。

標(biāo)準(zhǔn)化為瘦體重，脂肪組織中PLD2的耗竭或抑制在黑暗階段增加EE（脂肪消耗），而且不影響呼吸交換率（RER）、自發(fā)活動(dòng)或食物攝入量（圖2I-L）。此外，在22℃或熱中性條件下，在一次注射βAR興奮劑CL后，PLD2 Ad - KO小鼠的最大產(chǎn)熱能力顯著高于對照組（圖2M）。總之，這些結(jié)果表明脂肪組織中的PLD2通過抑制其產(chǎn)熱能力來抑制EE。

圖2脂肪細(xì)胞特異性PLD2缺乏或藥物抑制激活脂肪組織中的生熱程序

3、脂肪細(xì)胞PLD2消融或藥物抑制可抵抗HFD誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗

作者下面研究CAY10594在誘導(dǎo)輕度肥胖后對小鼠的治療作用（圖3A）。CAY10594處理10周的肥胖小鼠，可以在不影響攝食量的情況下抑制體重增加（圖3B-D）。在肥胖小鼠中抑制PLD2活性顯著降低脂肪質(zhì)量以及epiWAT、ingWAT和肝臟的組織重量（圖3E-F）。眾所周知HFD誘導(dǎo)的表型肥胖，如脂肪肝和脂肪細(xì)胞肥大的組織學(xué)證據(jù)在注射CAY10594的小鼠在HFD上被阻止（圖3G）。與降低肥胖一致，在肥胖小鼠中注射CAY10594增強(qiáng)暗期的EE（圖3H）。重要的是，在飲食誘導(dǎo)的肥胖過程中抑制PLD2顯著改善口服葡萄糖耐量和胰島素敏感性（圖3I-J）。

接下來作者探索脂肪細(xì)胞特異性敲除PLD2對HFD誘導(dǎo)的肥胖的影響。與對照小鼠相比，PLD2 Ad - KO小鼠對HFD誘導(dǎo)的肥胖具有抵抗力（圖3K-L），盡管食物攝入量與沒有差異（圖3M）。與對照小鼠相比，PLD2 Ad - KO小鼠的脂肪質(zhì)量、脂肪組織重量以及脂肪組織和肝臟中的脂質(zhì)積累在HFD處理12周后有所減少（圖3N-R）。脂肪組織中PLD2的耗竭，無論喂食或禁食都降低葡萄糖和胰島素水平（圖3S-T）。與此一致的是，與對照組小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的PLD2 Ad - KO小鼠的糖代謝和胰島素敏感性有所改善（圖3U-V）。脂肪細(xì)胞特異性敲除PLD2增強(qiáng)胰島素刺激的Akt和GSK3 β磷酸化（圖3W）。這些結(jié)果表明，靶向PLD2活性可以預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖和葡萄糖不耐受。

圖3 PLD2靶向小鼠的肥胖和2型糖尿病的改善

4、PLD2通過p62調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量和數(shù)量

先前的報(bào)道表明BAT線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要自噬，p62在通過調(diào)節(jié)線粒體自噬控制線粒體質(zhì)量方面具有重要作用。于是作者研究脂肪細(xì)胞特異性PLD2缺失或抑制對HFD喂養(yǎng)小鼠ingWAT和BAT中p62表達(dá)的影響。注射PLD2 Ad-KO和CAY10594的小鼠顯示ingWAT和BAT中p62和UCP1水平顯著升高（圖4A和B）。為評估PLD2對p62表達(dá)的直接作用，作者抑制PLD2在蛋白和mRNA水平上顯著誘導(dǎo)p62表達(dá)，類似于β3AR激動(dòng)劑CL的作用（圖4C），表明PLD2活性對p62具有細(xì)胞自主作用。此外，作者證明p62通過敲除CAY10594處理過的原代棕色脂肪細(xì)胞中的PLD2抑制對UCP1水平和產(chǎn)熱基因表達(dá)的影響（圖4D-E）。

基于p62在改善線粒體功能中的作用，作者接下來詢問PLD2是否也調(diào)節(jié)線粒體功能。CAY10594處理后3小時(shí)增強(qiáng)p62在線粒體中的定位（圖4F）。透射電鏡和線粒體DNA /核DNA比值分析表明，與對照相比，PLD2缺失或抑制顯著增加線粒體數(shù)量和質(zhì)量（圖4G-J）。作者想知道除了增加線粒體數(shù)量外，靶向PLD2是否也能改善線粒體質(zhì)量。研究使用棕櫚酸鹽破壞線粒體膜電位，通過四甲基羅丹明甲酯（TMRM）評估線粒體功能。棕櫚酸增加原代BAT的TMRM低群體，但減少TMRM高線粒體群體，而這一群體被PLD2抑制劑CAY10594的治療有效地逆轉(zhuǎn)了（圖4K）。在棕色脂肪細(xì)胞中抑制或耗竭PLD2顯著增強(qiáng)耗氧速率和寡霉素不敏感呼吸的程度（圖4L-O）。總之，PLD2負(fù)調(diào)控p62，線粒體功能和能量。結(jié)果表明PLD2參與線粒體生物學(xué)的多個(gè)方面。

圖4 p62調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞特異性PLD2消融或PLD2藥物抑制管理小鼠的線粒體質(zhì)量和數(shù)量

結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，作者證明在飲食誘導(dǎo)的適應(yīng)性產(chǎn)熱和肥胖過程中，PLD2和UCP1水平之間存在反比關(guān)系。通過在脂肪組織中進(jìn)行基因敲除或?qū)LD2進(jìn)行藥理學(xué)抑制，本研究認(rèn)為PLD2是脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱和EE的負(fù)調(diào)控因子，是預(yù)防肥胖、胰島素抵抗和葡萄糖不耐受的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Kim HS, Park MY, Yun NJ, Go HS, Kim MY, Seong JK, Lee M, Kang ES, Ghim J, Ryu SH, Zabel BA, Koh A, Bae YS. 2022. Targeting PLD2 in adipocytes augments adaptive thermogenesis by improving mitochondrial quality and quantity in mice. J Exp Med. 219(2):e20211523. doi: 10.1084/jem.