環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，在許多疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而難治性轉(zhuǎn)移性骨肉瘤（OS）標準治療的臨床療效不理想，新興的抗血管生成方案仍處于嬰兒期。本研究發(fā)現(xiàn)circFIRRE是OS腫瘤發(fā)生和血管生成的主要調(diào)控因子，并從體外和體內(nèi)初步驗證YY1-circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。這些結(jié)果提示circFIRRE能夠作為一種新的預(yù)后生物標志物和難治性O(shè)S的治療靶點。本研究于2022年8月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444的期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.      circFIRRE在OS樣品和細胞中的篩選和表征

作者通過rRNA-depleted RNA-seq分析四對OS組織和正常相鄰樣本的circRNA表達圖譜。表達異常的circRNA以火山圖的形式展現(xiàn)在圖1A中。作者選出前五個表達上調(diào)的circRNA，分別是circRUNX2（hsa_circ_0003563）、circSATB2（hsa_circ_0003915）、circFIRRE（hsa_circ_0001944）、circAFF2（hsa_circ_0001947）和circBBS9（hsa_circ_0003162）。然后開展對16對樣本中的這五種異常表達的circRNA進行RT-qPCR分析工作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circFIRRE因OS組織和鄰近的組織差異最大而差異表達最顯著（圖1B）。擴大樣本量至104對匹配的臨床OS樣本和鄰近正常樣本，RT-qPCR分析結(jié)果顯示，circFIRRE表達顯著上調(diào)（圖1C）。另外，F(xiàn)ISH實驗使用五對新鮮的患者樣本也證實了上調(diào)趨勢（圖1D）。與成骨細胞系（hFOB1.19）相比，143B、SJSA-1、HOS、U2OS和MG63這五個細胞系的circRNA表達顯著上調(diào)，特別是U2OS和MG63（圖1E）。circFIRRE的亞細胞定位在細胞功能中是很重要的。作者經(jīng)過核質(zhì)分離后的RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)中circFIRRE表達在U2OS和MG63細胞中也顯著上調(diào)（圖1F-G），RNA FISH實驗表明circFIRRE約有80%在細胞質(zhì)中，20%在細胞核中（圖1H）。circFIRRE的確切大小為1096 bp，其特異的反式剪接被Sanger測序證實（圖1I）。用放線菌素D處理MG63和U2OS細胞后檢測circFIRRE的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其可以在轉(zhuǎn)錄上抑制RNA合成，circFIRRE的半衰期大于24小時，比linearFIRRE在轉(zhuǎn)錄上更穩(wěn)定，linear FIRRE的半衰期小于5 h（圖1J-K），circFIRRE能抵抗RNase R酶的消化，而FIRRE在處理后很容易降解（圖1L-O）。這些結(jié)果提示circFIRRE可以在OS細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達，也可能成為診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標志物。

考慮到反剪接可能來自反式剪接或基因組重排，因而采用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）排除基因組重排的可能性。circFIRRE和linearFIRRE分別用發(fā)散引物和收斂引物在OS細胞的cDNA和基因組DNA提取物中擴增。AGE檢測發(fā)現(xiàn)circFIRRE只存在于cDNA中，而不存在于基因組DNA中（圖1P-Q）。

圖1 識別和驗證OS組織和細胞中下調(diào)的circFIRRE。

2.      circRNA上調(diào)預(yù)示OS病人的腫瘤轉(zhuǎn)移風險更大和不良預(yù)后

為評估總生存期（OAS）和無病生存期（DFS）的危險因素，作者進行采單因素和多因素分析。單因素分析顯示，年齡、手術(shù)方式、腫瘤轉(zhuǎn)移和circFIRRE高表達與OAS和DFS相關(guān)。在這些變量中，多因素分析顯示年齡、手術(shù)方式、circFIRRE轉(zhuǎn)移和表達升高是OS患者預(yù)后的獨立危險因素（圖2A-D）。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示circFIRRE高表達組的OAS和DFS比circFIRRE低表達組更低（圖2E-F）。circFIRRE的高表達水平與較短的生存期、較差的臨床結(jié)果和較高的風險評分呈正相關(guān)（圖2G）。以上結(jié)果說明circFIRRE可作為OS患者的獨立危險因素，參與OS的進展和轉(zhuǎn)移。 

圖2 確定circFIRRE作為預(yù)測OS預(yù)后的獨立危險因素。

3.      circFIRRE促進體外OS的進展

為調(diào)查OS的生物狀態(tài)的標志，作者們展開特征基因集的GSEA分析。在MG63和U2OS中建立circFIRRE穩(wěn)定敲除細胞系（圖3A）。然后，作者們執(zhí)行CCK8和EdU檢測OS細胞增殖能力。結(jié)果顯示，與陰性對照細胞相比，sh-circFIRRE細胞增殖及EdU結(jié)合顯著降低（圖3B-F）。Transwell遷移和侵襲實驗中，circFIRRE下調(diào)降低OS細胞遷移和侵襲的能力（圖3G-I）。流式細胞術(shù)評估細胞周期，發(fā)現(xiàn)sh-circFIRRE細胞被阻滯在G0/G1期，表明circFIRRE敲低可促進細胞周期阻滯。這些說明circFIRRE敲低體外抑制OS腫瘤生長和活性。RT-qPCR驗證過表達效率，并證實轉(zhuǎn)染不影響linearFIRRE表達（圖3J）。CCK8和EdU分析顯示circFIRRE過表達顯著促進MG63和U2OS增殖（圖3K-O）。這些說明circFIRRE參與體外OS的生長、遷移和侵襲。

圖3 體外circFIRRE影響OS的生長、遷移和侵襲。

4.      circFIRRE誘導(dǎo)血管生成

作者推測circFIRRE在OS肺轉(zhuǎn)移中可能參與血管生成。為驗證猜想，作者對轉(zhuǎn)移性O(shè)S組織內(nèi)皮細胞中circFIRRE是否富集進行研究。作者們從局限性骨肉瘤患者和三個臨床轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的樣本中獲得原發(fā)性內(nèi)皮細胞，通過CD31+磁珠分選，檢測circFIRRE在內(nèi)皮細胞中的差異表達（圖4A）。RT-qPCR分析顯示，相對于非轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的內(nèi)皮細胞，轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的circFIRRE顯著上調(diào)（圖4B），揭示其在血管生成和OS轉(zhuǎn)移中的潛在作用。三種常見的內(nèi)皮細胞系（HUVEC，EA.hy926，hmec1），HUVEC細胞circFIRRE表達水平最高。因此，作者選擇HUVEC進行血管生成研究。將三個circFIRRE靶向siRNAs轉(zhuǎn)入HUVEC細胞，發(fā)現(xiàn)si-1和si-2具有較好的敲低效果，降低50%以上的circFIRRE表達水平（圖4D）。si-1和si-2將用作后面的功能實驗。tube formation assay再次驗證，與對照組相比，si-circFIRRE顯著降低HUVEC細胞的增殖、遷移和管形成能力（圖4E-F）。主動脈環(huán)檢測顯示，si-circFIRRE轉(zhuǎn)染的主動脈環(huán)在膠原中包埋7天，微血管面積較正常組小（圖4G）。CAM是一種血管高度分化的雞胚外膜，si-circFIRRE共孵育后新形成的血管明顯受損（圖4H）。這些結(jié)果表明circFIRRE下調(diào)顯著抑制血管生成。對新芽進行tube formation assay，結(jié)果顯示circFIRRE過表達顯著增加HUVEC細胞的分支點和毛細血管長度（圖4I-J）。CAM和主動脈環(huán)實驗表明circFIRRE也能促進血管生成（圖4K-L）。上述這些結(jié)果說明circFIRRE可促進腫瘤轉(zhuǎn)移時的新生血管形成。

圖4 circFIRRE誘導(dǎo)體內(nèi)、體外腫瘤轉(zhuǎn)移時的新生血管形成。

5.      YY1調(diào)控OS中circFIRRE的表達

鑒于circFIRRE在OS中顯著上調(diào)，作者們假設(shè)circFIRRE在人類OS發(fā)育中受上游轉(zhuǎn)錄因子（TF）調(diào)控。作者從UCUS基因瀏覽器中檢索到FIRRE的啟動子，用三種算法來預(yù)測能與啟動子結(jié)合的潛在的TFs，發(fā)現(xiàn)Yin Yang 1（YY1）是這些算法中唯一的轉(zhuǎn)錄因子（圖5A）。然后檢測了35對OS樣本中YY1的表達水平，發(fā)現(xiàn)相對于相鄰的正常對照，circFIRRE在OS樣本中高表達，并且與circFIRRE的表達水平呈正相關(guān)（圖5B-C）。在細胞水平上，相比于hFOB1.19細胞，MG63和U2OS細胞YY1表達相對上調(diào)（圖5D）。隨后，作者將circFIRE的啟動子序列與JASPAR中的YY1結(jié)合基序進行比對，預(yù)測circFIRE啟動子中2個可能的YY1結(jié)合位點（圖5E），并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了2個可能的結(jié)合位點。在野生型（WT）組中，過表達YY1后，circFIRRE啟動子的熒光素酶活性增強，而結(jié)合位點1或2的突變部分挽救了這種增強效應(yīng)，而同時突變結(jié)合位點1和2時，熒光素酶活性沒有顯著變化（圖5F）。為探究YY1對circFIRRE和linearFIRRE表達變化的影響，作者設(shè)計了3條YY1的siRNA，并選擇敲低效果較好的si-YY1-1進行后續(xù)實驗（圖5G）。YY1敲低后，circFIRRE在MG63和U2OS中的表達顯著下調(diào)，而線性FIRRE表達下調(diào)幅度最小，說明兩組間無顯著性差異（圖5H-I），YY1過表達是相反的結(jié)果（圖5J-L）。這些結(jié)果表明YY1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用很可能主要是針對circFIRRE，而不是對線性FIRRE的調(diào)控。即：YY1可能是OS中circFIRRE轉(zhuǎn)錄的激活因子。

圖5 YY1激活circFIRRE轉(zhuǎn)錄。

6.      circFIRRE在OS細胞中海綿miR-486-3p和miR-1225-5p

鑒于circFIRRE主要在細胞質(zhì)中表達，作者推測circFIRRE可能作為miRNA海綿中和miRNA介導(dǎo)的基因沉默。首先，針對RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的核心成分AGO2（氬氣RISC催化組件2）蛋白進行RNA免疫沉淀。結(jié)果顯示，circFIRRE被AGO2 pull down特異性富集，而非免疫球蛋白G（IgG）（圖6A-C），提示circFIRRE可能與RISC結(jié)合并海綿化相應(yīng)的miRNA。然后應(yīng)用了五種算法預(yù)測circFIRE的潛在靶miRNA，并從數(shù)據(jù)庫間的重疊中確定miR-486-3p和miR-1225-5p為候選miRNA（圖6D）。RT-qPCR檢測circFIRRE對miR-486-3p和miR-1225-5p表達水平的影響。結(jié)果表明，這兩個miRNAs在35個配對的OS樣本和細胞系中相對于鄰近的正常對照和成骨細胞的表達顯著下調(diào)（圖6E），并且與circFIRRE表達呈負相關(guān)（圖6H-I）。FISH實驗進一步證實了這種模式（圖6F-G）。然后，通過circFIRRE敲低（si-circFIRRE-1）顯著上調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達水平，反之下調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達水平（圖6J-K）。這些結(jié)果表明miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中相對低表達，并受circFIRRE的負調(diào)控。

此外，利用特異性生物素標記的circFIRRE探針，通過pull-down實驗研究circFIRRE是否可以直接結(jié)合這兩個miRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于寡核苷酸探針，circFIRRE探針能夠特異性富集細胞裂解液中的circFIRRE、miR-486-3p和miR-1225-5p（圖6L-M）。pull-down實驗進一步驗證，與對照探針相比，特異性生物素標記的miR-486-3p和miR-1225-5p探針成功捕獲circFIRRE（圖6N-O）。將熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-486-3p或miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，進行雙熒光素酶報告實驗。結(jié)果顯示，與陰性對照miRNA相比，miR-486-3p和miR-1225-5p協(xié)同將熒光素酶活性至少降低50%。隨后從熒光素酶報告質(zhì)粒中突變預(yù)測的miRNA結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)miRNA轉(zhuǎn)染后突變的熒光素酶活性保持不變（圖6P）。在MG63和U2OS細胞中，circFIRRE與相應(yīng)的miRNAs通過雙重FISH實驗共定位，支持了上述結(jié)果（圖6Q-R）。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE可能作為miR-486-3p和miR-1225-5p的海綿發(fā)揮作用。

圖6 circFIRRE充當miR-486-3p和miR-1225-5p的海綿。

7.        體外circFIRRE通過miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1軸促進骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成

基于以前的研究，作者推測circFIRRE可能通過抑制兩種miRNA的保護作用，激活下游基因，促進骨肉瘤進展和新生血管形成。作者首先尋找miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中的靶基因。通過3種預(yù)測算法（miRDB、TargetScan和RNAInter）和RNA-seq數(shù)據(jù)交叉分析，發(fā)現(xiàn)LUZP1（亮氨酸拉鏈蛋白1）是重疊基因中唯一的預(yù)測基因（圖7A）。RT-qPCR驗證正常鄰近樣本相比，LUZP1在35對臨床OS樣本中上調(diào)（圖7B），發(fā)現(xiàn)它們與miR-486-3p和miR-1225-5p表達水平呈負相關(guān)，與circFIRRE呈正相關(guān)（圖7C-E）。作者將熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-486-3p和miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞，研究這兩個miRNAs與LUZP1之間的相互作用。LUZP1 3′-UTR降低的熒光素酶活性伴隨著miRNA的過表達。相反，與LUZP1 3′-UTR突變后的對照相比，熒光素酶活性保持不變（圖7F）。研究采用RT-qPCR和Western blot進行拯救實驗。結(jié)果顯示，si-circFIRRE-1引起的內(nèi)源性LUZP1下調(diào)在mRNA和蛋白水平被miR-486-3p或miR-1225-5p抑制劑部分挽救（圖7G-H）。Wound healing assay和Transwell遷移和侵襲實驗表明，miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯消除對sh-circFIRRE-1細胞遷移和侵襲的抑制作用（圖7I-J）。此外，tube formation assay顯示miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯增加了si-circFIRRE-1細胞中減少的分支點和毛細血管長度（圖7K-L）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE在體外至少部分通過miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路促進OS進展和新生血管形成。

圖7 體外circFIRRE通過miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1軸促進骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成。

8.      circFIRRE通過海綿化miRNA促進OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移

為驗證circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p軸在體內(nèi)的功能，研究構(gòu)建原位異種移植瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型。將熒光染料標記的MG63細胞注入右脛骨骨髓腔，建立原位異種移植瘤模型（每組10個）。熒光素酶強度顯示circFIRRE敲低明顯降低原位腫瘤大小，抑制骨肉瘤細胞增殖，而miR-486-3p和miR-1225-5p抑制減輕這種損傷（圖8A）。在注射后5周進行micro-CT掃描和三維重建以評估腫瘤發(fā)生引起的骨破壞情況。結(jié)果表明，對照組出現(xiàn)嚴重的脛腓骨和關(guān)節(jié)破壞，sh-circFIRRE組骨破壞減輕，而miR-486-3p和miR-1225-5p海綿拯救了sh-circFIRRE的修復(fù)（圖8B）。注射后5周，處死小鼠，獲取OS病灶進行免疫組化（IHC）和蛋白分析。IHC結(jié)果顯示，細胞增殖標志物ki-67顯示腫瘤增殖活性減弱，間質(zhì)標志物N-cadherin和顯示EMT能力受到抑制。在shcircFIRRE-1組中Vimentin和上皮標志物E-cadherin，而這些腫瘤特征被miRNA海綿拯救（圖8C）。在sh-circFIRRE-1組中觀察到LUZP1的蛋白水平相對于對照組下調(diào)，而在IHC和Western bolt分析中抑制miR-486-3p和miR-1225-5p部分消除了下調(diào)（圖8D-E）。

為了進一步研究circFIRRE如何調(diào)節(jié)腫瘤肺轉(zhuǎn)移和血管生成，作者通過將穩(wěn)定的熒光素酶標記的MG63細胞注射到裸鼠的側(cè)尾靜脈中（每組10只小鼠），構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。注射后4周，根據(jù)IVIS實驗中熒光素酶的強度，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠肺野內(nèi)有彌漫性轉(zhuǎn)移；sh-circFIRRE組的肺區(qū)相對清晰，無廣泛轉(zhuǎn)移；與sh-circFIRRE組相比，沉默miR-486-3p和miR-1225-5p顯著增加了肺轉(zhuǎn)移的程度和轉(zhuǎn)移病灶的大小（圖8F）。同樣，micro -CT掃描和三維重建顯示，與對照組相比，sh-circFIRRE組的腫瘤體積和數(shù)量顯著減少（圖8G-I），而與sh-circFIRRE組相比，sh-circFIRRE和miRNAs海綿組的轉(zhuǎn)移病灶體積和數(shù)量增加。切除的肺在光照和蘇木精和伊紅染色下的照片進一步證實這一結(jié)論（圖8J-K）。轉(zhuǎn)移OS中VEGF和CD31染色顯示，對照組和miRNAs海綿組的血管生成均被顯著激活，而在sh-circFIRRE-1組中血管生成被抑制（圖8L-M）。IHC和Western blot驗證轉(zhuǎn)移灶中LUZP1表達的相應(yīng)變化（圖8N-O）。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE通過在體內(nèi)吸附miR-486-3p / miR-1225-5p促進骨肉瘤的原位生長、肺轉(zhuǎn)移和血管生成。

圖8 circFIRRE通過海綿化miRNAs促進OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

結(jié)論

總之，與相鄰的正常樣本相比，OS患者樣本中circFIRRE表達上調(diào)。circFIRRE表達升高與不良臨床表現(xiàn)呈正相關(guān)。體外和體內(nèi)初步驗證了YY1-circFIRRE-miR-486-3p/ miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。研究首次闡明circFIRRE在OS腫瘤發(fā)生和血管生成中的作用，可能為難治性O(shè)S等腫瘤中circRNAs的分子生物學(xué)、診斷和治療研究提供有用的參考。

參考文獻

Yu L, Zhu H, Wang Z, Huang J, Zhu Y, Fan G, Wang Y, Chen X, Zhou G. (2022) Circular RNA circFIRRE drives osteosarcoma progression and metastasis through tumorigenic-angiogenic coupling. Mol Cancer. 21(1):167. doi: 10.1186/s12943-022-01624-7.