癌癥相關成纖維細胞(CAFs)參與腫瘤生長、血管生成、轉移和治療抵抗。近日，有研究探索肝細胞癌(HCC)中CAFs的特征，并建立一個基于CAFs的風險標簽，用于預測HCC患者的預后。該研究發表在《Frontiers in immunology》，IF：8.786。

技術路線：

主要研究結果：

1. 篩選scRNA-seq樣品中的CAFs

本研究的流程圖如圖1所示。初步篩選后，從scRNA-seq數據中共獲得69,145個細胞(表1)。圖2A為21個樣本分布的TSNE圖，生成了4個CAF聚類 (圖2B)。4個CAF簇中共鑒定出211個DEGs，其中排名前5位的DEGs(被確定為CAF簇的標記基因)在4個簇中的表達如圖2C所示。每個隊列中4個集群的比例見圖2D。這些DEGs富集于多條通路，包括血管平滑肌收縮、黏著斑、催產素信號通路、PPARG信號通路等（圖2E）。此外，根據CNV特征，4個CAF簇由1533個腫瘤細胞和正常細胞組成(圖2F)。

圖1 本研究實驗流程圖

表1樣品過濾前后的細胞計數

圖2基于HCC患者scRNA-seq數據識別CAF集群

2. CAF中癌相關途徑的表達

不同CAF簇中10條腫瘤相關通路的GSVA評分如圖3A所示。CAF_0簇中的惡性細胞比例顯著高于其他三個簇(圖3B)。而CAF_1、CAF_2、CAF_3之間差異無統計學意義。進一步分析每個CAF簇中惡性與非惡性細胞間10條腫瘤相關通路的GSVA評分，發現有輕微差異(圖3C-F)。為了確定CAF集群和預后之間的關聯，首先基于TCGA隊列計算了每個CAF集群的標記基因(圖2C中定義的CAF集群的前5個DEGs)的ssGSEA評分。結果表明，CAF_2簇在腫瘤樣本中的評分顯著高于正常樣本，而其他CAF簇的趨勢相反，正常樣本中的評分高于腫瘤樣本(圖4A)。根據survminer R包分析的最佳截斷值將TCGA數據集的HCC樣本分為高CAF評分組和低CAF評分組。高CAF評分組樣本在CAF_0、CAF_1和CAF_2簇中的預后優于低CAF評分組樣本，而CAF_3與HCC的預后無關(圖4B-E)。上述結果表明，盡管肝癌和正常樣本的CAF_3富集不同，但CAF_3簇可能在肝癌進展中作用不大。

圖3 CAF簇中腫瘤相關通路的特征

圖4 4種CAF聚類與HCC患者預后的關系

3. 與CAF相關的關鍵基因的鑒定

為了構建風險標簽，首先在腫瘤和正常組織之間篩選出DEGs。如圖5A所示，共獲得2349個DEGs，其中462個上調，1887個下調。其中，有423個基因與這些預后相關的CAF集群顯著相關。進一步通過單因素Cox回歸分析評估每個基因的預后價值，有234個基因具有預后價值(圖5A, B)。Lasso Cox回歸分析縮小基因數量，剩下11個基因lambda=0.047(圖5C, D)。采用逐步回歸法進行多因素Cox回歸分析后，最終納入6個基因 (圖5E)。根據每個樣本的風險評分，將樣本分為高風險組和低風險組。在TCGA隊列和GEO隊列中，1 ~ 5年生存率模型的AUC值范圍分別為0.68 ~ 0.76和0.65 ~ 0.7(圖5F, G)。Kaplan-Meier生存分析顯示，高危患者的生存結局顯著劣于低危患者(圖5H, I)。

圖5確定用于構建風險標簽的核心預測基因

4. 關鍵基因突變及通路分析

檢測該風險標簽的6個基因的SNV突變情況。結果顯示，ADAMTSL2、SLCO2A1、HMGXB3、LUC7L3和CD4在更多的樣本中有SNV突變并均無顯著的共現概率，而GCN1中未觀察到SNV突變，且在這6個基因中只有非常少的樣本有CNV的獲得/丟失(圖S4A-C)。此外，SLCO2A1與非整倍體評分、同源重組缺陷、改變的部分、節段數量和非沉默突變率呈顯著負相關，而HMGXB3、LUC7L3和GCN1與同源重組缺陷和改變的部分呈顯著正相關(圖S4D)。接下來，還分析了與每個風險基因相關的潛在通路，與這6個基因顯著相關的通路共有39條，包括血管生成、頂端連接、凋亡等（圖6A和B）。

圖S4風險特征中包含的基因突變的特征

圖6識別風險基因參與的通路

5. 核心基因與免疫的關系

ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4與間質評分、免疫評分和估計值呈顯著正相關，而LUC7L3與間質評分、免疫評分和估計值呈顯著負相關。然而，三種評分與其他基因(GCN1和HMGXB3)之間沒有觀察到顯著的相關性(圖S5A)。根據各基因表達量的中位數分組后，比較不同表達組的3個評分。結果顯示，對于ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4基因，高表達組的三個評分均顯著高于低表達組(圖S5B)。相關性分析顯示ADAMTSL2、SLCO2A1、CD4與大部分T細胞呈顯著負相關。此外，LUC7L3、GCN1和HMGXB3與M0巨噬細胞和中性粒細胞呈顯著正相關(圖S5C)。幾種免疫細胞中風險基因的高表達組和低表達組之間存在顯著差異(圖S5D)。

圖S5風險基因與免疫景觀的關系

6. 風險特征對PD-L1阻斷免疫治療的反應性

T細胞免疫療法已成為一種具有協同生存獲益的抗癌療法。IMvigor210隊列中的348例患者對抗PD- l1受體阻滯劑表現出不同程度的緩解，包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。SD/PD患者的風險評分高于CR/PR患者(圖7A)。在高危組中，SD/PD百分比高于低危組(圖7B)。在IMvigor210隊列中，與高危組患者相比，低危組患者顯示出顯著的臨床獲益和顯著較長的總生存期(圖7C, p=0.0053)。具體來說，I+II期患者在不同風險組之間有顯著的生存差異(圖7D, p=0.0017)，但在III+IV期患者中無顯著差異(圖7E, p=0.5)，提示風險評分在早期患者中更敏感。在GSE78220隊列中，還發現低危組患者的總生存期顯著長于高危組(圖7F, p=0.036)，高危組的SD/PD百分比高于低危組(圖7G)。

圖7 IMvigor210隊列中風險評分對PD-L1阻斷免疫治療的反應性

8. 確定獨立危險因素并繪制列線圖

多因素分析顯示，風險標簽是影響骨肉瘤患者預后的最重要的獨立因素，其次是轉移狀態 (圖8A、B)。因此，構建了聯合分期和風險評分的列線圖（圖8C）。校準圖顯示，列線圖可以有效預測實際生存結局(圖8D)。此外，DCA顯示列線圖對高危患者的識別能力優于風險評分和分期（圖8E）。TimeROC分析顯示，風險評分和列線圖的AUC高于TCGA隊列中的其他指標(圖8F)。

圖8建立預測肝癌預后列線圖

結論：

綜上所述，該研究系統地描述了HCC中CAF群體的特征，并產生了4個具有顯著多樣性的CAF集群。4個聚類之間的DEGs富集在血管平滑肌收縮、黏著斑、催產素和PPARG信號通路等。其中3個基因簇與HCC預后顯著相關，并用于構建一個基于6個基因的預后風險標簽。作者觀察到基于CAF的基因標簽與免疫景觀相關，可以用于預測對PD-L1阻斷免疫治療的反應性。最后，基于風險標簽和臨床病理特征建立了一種新的列線圖模型，該模型對HCC患者的臨床結局具有良好的預測性能。