Circular RNA ( circRNAs )是一類缺乏5′cap結構和poly ( A )尾的閉環非編碼RNA。N6-甲基腺苷（m6A）修飾可增強結合mRNA/long noncoding RNAs（lncRNAs）轉化為microRNAs（miRNAs）的能力。結直腸癌（colorectal cancer , CRC）是中國女性癌癥死亡的第二大原因，死亡人數僅次于肺癌，但是機制尚不清楚。本研究的目的是研究circALG1是否能夠成為CRC的潛在治療靶點和預后標志。結果證實：m6A修飾可增強circALG1與miR-342-5p的結合能力，促進circALG1的ceRNA功能，circALG1可能成為CRC的潛在治療靶點和預后標志。本研究于2022年3月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術路線：

主要研究結果：

1、  circALG1在CRC中高表達

circRNA的芯片分析結果顯示，353個circRNAs在CRC患者癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（圖1A），54個circRNAs在CRC患者外周血中的表達水平高于健康人（圖1B）。通過分析circRNAs在結直腸癌組織和外周血中的高表達，研究鑒定了2個circRNA，即circALG1和circCOL6A3 （圖1C）。然后使用在線網站SRAMP ( http://www.cuilab.cn/sramp)發現這兩個circRNAs都可以經歷這種修飾。由于circALG1在CRC患者的組織和外周血中的整體表達水平高于circCOL6A3，所以，選擇了circALG1作為后續研究的重點。此外，作者利用基因表達譜（Gene Expression Omnibus，GEO）中的GSE126094數據集進行驗證，發現在CRC癌組織中circALG1的表達水平明顯高于癌旁組織（圖1D）。從CRC患者、術前及術后收集40對癌組織及癌旁組織，20例CRC患者術后1周血標本，15例健康人外周血標本進行qRT-PCR實驗。結果顯示，circALG1在CRC患者的癌組織（圖1E）和外周血（圖1F）中均高表達。更有趣的是，CRC患者術后1周外周血中circALG1的表達水平顯著降低（圖1G）。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示，circALG1在CRC患者癌組織及癌旁組織（圖1H）、CRC患者及健康體檢者外周血（圖1I）、CRC患者術前及術后外周血（圖1J）中的表達水平均有較好的區分。

圖1 circRNA表達譜分析顯示，circALG1在CRC中高表達。

2、  CRC細胞中circALG1的特征

針對circALG1的成環位點設計了聚合引物和發散引物。瓊脂糖凝膠電泳顯示，聚合引物在cDNA和gDNA中均擴增出條帶，而發散引物只在cDNA中擴增出條帶。進一步的cDNA測序發現有成環存在（圖2A），表明circALG1具有循環性。與親本基因ALG1 mRNA相比，circALG1對RNase R消化表現出抵抗性（圖2B）。經放線菌素處理后，circALG1在細胞中的降解速率明顯慢于ALG1 mRNA （圖2C），說明circALG1是穩定的。核質分離實驗顯示，circALG1主要定位于細胞質（圖2D）。同樣的結果也來自于circALG1 FISH （圖2E）。

圖2 CRC細胞中circALG1的特性。

3、  circALG1在體外和體內均可促進結直腸癌轉移

研究檢測了circALG1在5種細胞系（FHC、HT29、HCT116、SW480和SW620）中的表達水平。與FHC細胞相比，circALG1在HT29和HCT116細胞中表達較低，在SW480和SW620細胞中表達較高。選取circALG1表達量最低的HCT116細胞和circALG1表達量最高的SW480細胞進行后續功能實驗。研究構建了穩定過表達circALG1的HCT116細胞，其過表達效率見。作者設計了3個針對circALG1干擾的siRNA，敲低效率見。利用si-3序列構建干擾circALG1表達的慢病毒，并構建穩定轉染細胞系。Transwell實驗結果顯示，過表達circALG1后HCT116細胞的遷移和侵襲能力增強（圖3A），沉默circALG1后SW480細胞的遷移和侵襲能力減弱（圖3B）。

然后，檢測親本線性ALG1是否會影響circALG1的功能，q RT-PCR結果顯示，circALG1的過表達和干擾對線性ALG1 m RNA的表達沒有影響。還構建了ALG1過表達質粒并轉染HCT116和SW480細胞。作者設計了3個針對ALG1干擾的siRNA，其敲除效率如附圖2B所示。在HCT116裸鼠轉移瘤模型中，circALG1過表達組肝、肺轉移數目較高（圖3C）；在SW480裸鼠轉移瘤模型中，干擾circALG1的表達減少了肝、肺轉移瘤的數量（圖3D）。這些結果表明，circALG1與CRC轉移密切相關。

圖3 circALG1在體內促進CRC轉移。

4、  m6A修飾后的circALG1增強了CRC的遷移和侵襲能力

使用在線網站SRAMP，發現circALG1極有可能進行m6A修改；此外，在甲基化RNA免疫沉淀( MeRIP )實驗中還觀察到了circALG1的富集，證實了circALG1確實發生了m6A修飾（圖4A）。作者研究了circALG1的m6A修飾水平對circALG1功能的影響：將circALG1中2個可能的m6A修飾位點突變后，構建野生型和突變型質粒（圖4B）。用等量的野生型和突變型質粒轉染circALG1穩定沉默的SW480細胞株。qRT-PCR分析顯示，不同組別之間的circALG1表達水平無差異（圖4C）；突變1個位點后，m6A修飾的circALG1細胞內水平降低，而突變2個位點后，細胞內均未見m6A修飾的circALG1（圖4D）。功能實驗表明，circALG1突變減少了腫瘤細胞的遷移和侵襲（圖4E）。這些結果表明，circALG1 m6A修飾水平與CRC細胞的遷移和侵襲能力呈正相關。

圖4 m6A修飾的circALG1促進SW480細胞的CRC轉移。

5、  circALG1通過作為miR?342?5p海綿促進CRC細胞的遷移和侵襲

circRNA通過多種機制發揮作用。最常見的機制是ceRNA；即通過競爭性結合miRNA，解除miRNA對靶基因mRNAs的抑制作用，這一過程在細胞質中進行。之前的研究顯示，circALG1主要定位于胞漿內，表明circALG1可能通過ce RNA介導CRC轉移。作者使用Arraystar miRNA靶預測軟件( Arraystar，Rockville，MD，USA )對miRNA應答元件( MREs )進行預測，得到5個最可能與circ ALG1結合的miRNA：miR-302d-3p、miR-342-5p、miR-372-3p、miR-483-5p和miR-520d-3p。

為了研究這5個miRNA與circALG1的相互作用，進行了如下實驗：構建含有circALG1野生型序列的SV40-firefly_Luciferase-MCS質粒，與miRNA模擬物和Renilla熒光素酶質粒共轉染。miR-342-5p組熒光活性減弱（圖5A），提示miR-342-5p可能與circALG1結合。然后檢測miR-342-5p在CRC組織中的表達水平，發現miR-342-5p在CRC組織中低表達。根據預測的circALG1與miR-342-5p的結合位點，設計了含有circALG1突變序列（圖5B左）的SV40 -螢火蟲_熒光素酶MCS質粒。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，轉染含有circALG1野生型序列的螢火蟲熒光素酶質粒后，miR-342-5p模擬物顯著降低了熒光強度，而miR-342-5p抑制劑增強了熒光強度。與含有circALG1突變序列的質粒( 圖 5B，右)相比，miR-342-5p與circALG1特異性結合。

在circALG1的RAP檢測中，作者也觀察到miR-342-5p富集（圖5C）。功能實驗顯示，在HCT116細胞中，miR-342-5p過表達逆轉了circALG1過表達誘導的遷移侵襲能力增強（圖5D），而在SW480細胞中，miR-342-5p抑制逆轉了circALG1沉默誘導的遷移侵襲能力降低（圖5E）。這些說明circALG1通過海綿吸附miR-342-5p促進CRC細胞的侵襲和遷移。

圖5 circALG1通過miR-342-5p促進CRC的遷移和侵襲。

6、  PGF是circALG1/miR?342?5p信號軸的下游靶點

為了確定circALG1 / miR-342-5p信號軸的下游靶基因，作者從circALG1沉默前后的SW480細胞中提取RNA進行RNA測序。共獲得76個表達量> 2倍上調的基因。對這76個基因的GO分析也顯示它們富集在與轉移相關的通路中。根據TargetScan網站和RNA測序預測，共有7個基因被鑒定為miR-342 - 5p下游靶基因(圖6A )。通過檢索生物信息學網站UALCAN ( http://ualcan. path.uab.edu / )，作者發現只有PGF在CRC中高表達，提示預后不良（圖6B-C，PGF在本研究收集的CRC標本中也高表達）。

相關性分析顯示，CRC組織中PGF的表達水平與miR-342-5p( R=-0.547 , p < 0.001 )呈負相關（圖6E）。雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，轉染含有PGF3’UTR野生型序列的螢火蟲熒光素酶質粒后，miR-342-5p模擬物降低了熒光素酶活性，而miR-342-5p抑制劑提高了熒光素酶活性。轉染含有PGF3′UTR突變序列的螢火蟲熒光素酶質粒后未觀察到類似現象，說明miR-342 - 5p能特異性結合PGF3′UTR，抑制其表達（圖6F）。在本研究中，PGF過表達顯著上調CRC細胞中ERK的磷酸化水平，降低和增加上皮間質轉化( epithelial-mesenchymal transition，EMT )相關標志物E-cadherin和vimentin的表達；PGF沉默后觀察到相反的結果（圖6I）。因此，PGF通過調控EMT影響CRC轉移。

在CRC標本中，作者也觀察到PGF高表達，p-ERK水平和vimentin表達增加，E-cadherin表達降低（圖6L）。綜上所述，PGF是circALG1/ miR-342-5p信號軸的下游靶基因。

圖6 PGF是circALG1/ miR-342-5p信號軸的下游靶點。

7、circALG1的m6A修飾增強了其與miR?342?5p的結合能力

研究利用穩定沉默了circALG1的SW480細胞，轉染構建的野生型和m6A修飾的突變體circALG1質粒，進行了circALG1的RAP檢測。結果顯示，circALG1 m6A修飾的減少，減弱了其與miR-342-5p的結合（圖7A）。作者還基于野生型和m6A修飾的突變體circALG1序列構建了相應的螢火蟲熒光素酶質粒。雙熒光素酶報告基因實驗表明，circALG1 m6A修飾位點的突變增強了熒光素酶的表達，且當m6A修飾位點同時突變時，熒光強度最高。這些結果表明miR-342-5p mimics對含有m6A修飾位點突變序列的circALG1螢火蟲熒光素酶質粒表達的抑制作用減弱，說明m6A修飾調控了circALG1與miR-342-5p的結合（圖7B）。

然后研究了m6A修飾影響circALG1與miR-342-5p結合的具體機制。在下調蛋白中也觀察到YTHDF1的存在（圖7C）。此外，在YTHDF1 RIP實驗中檢測到circALG1的富集（圖7D）。當circALG1 m6A修飾位點發生突變時，YTHDF1 RIP檢測結果顯示，富集的circALG1顯著降低，說明circALG1與YTHDF1的結合依賴于m6A修飾（圖7E）。在含有circALG1-mut3序列的螢火蟲熒光素酶質粒中，由于缺少m6A修飾位點，METTL3沉默后對熒光素酶活性沒有影響（圖7J）。這一結果也提示m6A修飾可以增強circALG1與miR-342-5p的結合能力。

圖7 circALG1的m6A修飾增強了其與miR-342-5p的結合能力

圖8 研究機制圖

結論

本研究首先通過人circRNA芯片技術和生物信息學分析發現circALG1 circALG1通過競爭性結合miR-342-5p，解除miR-342-5p對PGF mRNA表達的抑制作用，促進PGF表達，導致CRC侵襲性增強。YTHDF1在CRC中的高表達增加了ALG1 pre-mRNA的m6A修飾水平，進而增加了circALG1的m6A修飾水平。circALG1的m6A修飾增強其與miR-342-5p的結合能力，并通過增強其穩定性促進circALG1的ceRNA作用。進一步促進了其ceRNA機制。這些實驗結果提示，circALG1可作為早期診斷和抗腫瘤轉移治療的潛在靶點。

參考文獻：

Lin, C., Ma, M., Zhang, Y. et al. The N6-methyladenosine modification of circALG1 promotes the metastasis of colorectal cancer mediated by the miR-342-5p/PGF signalling pathway. Mol Cancer 21, 80 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01560-6