靈長類動物和嚙齒類動物大腦在大小和功能上的差異，以及興奮/抑制平衡紊亂與許多神經發育障礙之間的關系，凸顯了研究靈長類神經元嵴(ganglionic eminences, GEs)發育的重要性。單細胞RNA-seq (Single cell RNA-seq, scRNA-seq)已應用于發育神經科學的研究。傳統的批量RNA-seq產生組織的混合表達數據，與此相比，scRNA-seq可以提供單細胞的轉錄譜具有如此高分辨率的技術可以區分不同的細胞類型，并促進對復雜神經系統的研究在小鼠中進行的單細胞研究揭示了胚胎發育過程中GE中間神經元的分子和轉錄特征的多樣性。然而，關于靈長類GE發育過程中抑制性神經元產生的研究報道很少，而且由于缺乏轉錄分析或轉錄分析的質量，嚙齒類和靈長類之間的保守性和異質性仍然有限此外，在復雜的細胞增殖，空間區分，譜系決定和中間神經元遷移的復雜調控網絡仍然不清楚。該研究發表于《Cell Research》，IF:46.297。

技術路線：

主要研究結果：

1. 靈長類胚胎發育早期階段的細胞多樣性

作者對三個食蟹猴和兩個人類胎兒的胚胎進行了基于微滴的單鏈RNA測序，以解剖和比較靈長類胚胎的發育特征。獼猴的樣本來自胃周7、10和12，此時GEs仍處于早期發育階段。人類樣本來自孕9和13周，可能處于類似的發育窗口期(圖1a)。經過測序、圖譜繪制和質量控制，作者獲得了來自人類的13,782個細胞和來自獼猴的29,269個細胞。然后通過Seurat3.0.45將兩個物種的數據進行整合，使用Unsupervised方法將不同的細胞聚類(圖1b)，作者檢測到21個細胞簇。每個簇都用那些細胞分類的知名標記進行注釋(圖1b)。作者從表達NRN1和SLA46,47的相鄰大腦皮層中移除了兩個興奮性神經元簇。作者還發現了由其相應標記CX3CR1和SLC4A148,49識別的小膠質細胞和血細胞簇，這些細胞簇也被移除。在剩余的GE來源細胞中，作者可以通過差異基因表達分析區分細胞與GE祖細胞和有絲分裂后細胞。神經祖細胞包括放射狀膠質細胞(radial glia cells, RGCs)和中間祖細胞(intermediate progenitor, IPCs)在GEs中高表達NES, VIM或ASCL1, DLL150(圖1c, d)。細胞周期中的增殖細胞可以用TOP2A51標記(圖1c, d)，有絲分裂后細胞可以進一步用區域特異性標記(圖1c)。MGE由特異性表達NKX2-1和LHX6的細胞組成，而LGE由MEIS2和ISLR2組成，CGE由NR2F1和NR2F2組成(圖1d)。然后作者計算了每一種細胞類型中人和獼猴細胞的歸一化細胞比例，并在河流圖中可視化，表明人和獼猴GE細胞分區之間沒有顯著差異(圖1e)。基于人類和獼猴不同細胞類型之間基因表達的相似性分析也證明了兩種物種數據整合的準確性(圖1f)。為了展示靈長類GEs的細胞發育軌跡，作者進行了RNA速度分析(scVelo) 52,53，這是一種通過重建轉錄變化的發育序列來推斷軌跡的方法。正如預測的那樣，來自GE祖細胞的細胞增殖并產生IPCs 54，然后在MGE、LGE和CGE中分化為各種譜系(圖1g)。綜上所述，作者的分析證實了獼猴和人類之間基本的進化保守性，揭示了人類和獼猴GEs細胞的多樣性和發展軌跡。

圖1 胚胎靈長類GEs的轉錄譜

2. 靈長類GE祖細胞的特異性細胞特性

在哺乳動物發育中的大腦中，神經元是由大腦皮質和GE中位于腦室區(VZ)的RGCs和位于腦室下區(SVZ)的IPCs產生55,56。作者將來自人類和恒河猴GE的神經祖細胞分為亞群，包括RGCs和IPCs(圖2a)。通過HES1、VIM和NES的高表達來區分RGCs，而通過ASCL1、HES6和dlx250,57的表達來區分IPC(圖2b)。在所有的RGCs中，作者觀察了不同GE祖細胞的區域一致性。NKX2-1, PAX6和NR2F2的表達分別代表MGE, LGE和CGE祖細胞(圖2c)。

對大腦皮質的研究表明，在靈長類新皮質中，SVZ/VZ外有一個特殊的增殖區域，稱為室管膜下區(outer subventricular zone, oSVZ) 56位于oSVZ的外放射狀膠質細胞(oRGs)不同于位于VZ的RGCs，它們被認為是靈長類動物，尤其是人類腦容量擴張的主要貢獻者值得注意的是，作者根據FAM107A、HOPX和TNC58的集中和特異性表達，在GEs的RGCs中識別出了靈長類動物特異性的外放射狀膠質細胞(oRGs)(圖2a, b)。作者對HOPX進行了免疫染色，并證實了HOPX在GW13人類和GW12獼猴LGE的VZ和SVZ以及遠離VZ的區域的表達，與皮質中的表達相似(圖2d)。然而，作者在小鼠GE或皮質中未觀察到任何陽性信號。這表明在靈長類動物大腦發育過程中，oRGs不僅存在于大腦皮層，也存在于大腦GEs中。

然后，作者試圖發現靈長類動物和小鼠之間的GE祖細胞的差異。作者將靈長類動物的數據與已發表的小鼠GE數據集集成，并對祖先集群進行子集。針對HES1+ RGCs，作者進行了不同物種之間的差異基因表達分析(圖2e)。作者確定了一組在人類和獼猴中高度表達的基因(圖2e)。在這些差異表達基因(DEGs)中，有一些是之前報道的在人類RGCs中特異性表達的基因，如MOXD1和TCIM58-60(圖2e和補充信息圖S2c)，這驗證了作者的發現。其他增殖相關基因如CLU61和VEPH1,62也可能導致物種差異(圖2e)。

RGCs到IPCs以及有絲分裂細胞到有絲分裂后細胞的轉變在腦發育過程中細胞的發育和分化中起著重要作用。IPCs分析顯示，在靈長類和小鼠中，G蛋白耦聯受體信號級聯的調節因子RGS16在剛剛進入有絲分裂后期的細胞中特異性表達(圖2f)。通過scATAC-seq進行的基因調控網絡顯示，RGS16受幾個增殖相關基因的調控，如PAX6、GLI3和HES565-67(圖2f)。此外，區域特異性標記物，如MGE中的NKX2-1, CGE中的NR2F2和LGE中的ISL1開始表達與RGS16表達減少相關。這些模式表明RGS16可能作為IPCs和細胞命運決定的前體細胞之間的過渡因子。

以上結果表明，oRGs存在于靈長類發育中的大腦和大腦皮層中，這可能是靈長類和嚙齒類動物物種差異的原因之一。

圖2 靈長類GE祖細胞的特征和人類與小鼠的比較

3. MGE和CGE中細胞命運的決定

為了描繪MGE中的發育譜系，作者選取了LHX6表達組進行進一步的差異基因表達分析和軌跡重建(圖3a)。作者檢測到四種不同的細胞類型，其中一種根據它們的基因表達譜推測是前體。其他三個分支分別由表達SST、LHX8和CRABP1的細胞組成(圖3b, c)。

MGE前體由轉錄因子NKX2-1、TOX3和PLS3的表達確定(圖3b)，這些轉錄因子在細胞成熟過程中逐漸表達。所有在MGE中推測的更成熟的細胞都表達NRXN1和CHL1，根據生物過程基因本體，它們的功能與細胞黏附和軸突投射相關(圖3d)。

在整個SST+中間神經元譜系中，ZEB2和PLS3與ERBB4和CXCR4等基因一起表達(圖3b)。已有研究報道ERBB4和CXCR4調控小鼠GE中間神經元向大腦皮層的切向遷移。這些模式提示，來源于MGE的SST+中間神經元會遷移到大腦皮層。

LHX8+細胞是MGE衍生的膽堿能投射神經元，定位于基底端腦。大部分LHX8+細胞在人類GW9和獼猴GW7的MGE中被檢測到，但在三個較老的樣本中幾乎沒有檢測到(圖3f)。同樣，在小鼠MGE中，E11和14時檢測到的LHX8+細胞比E17時多得多。這表明LHX8+膽堿能投射神經元可能在靈長類動物大腦發育的早期產生，這與小鼠的發現一致。

作者還發現了一小群與LHX8+細胞一起特異性表達CRABP1和ANGPT2的細胞(圖3b-e)。作者對這兩組細胞進行了獨立分析，以便找到更多關于它們的細節。特征圖顯示ANGPT2的表達與LHX8完全分離，而CRABP1在一小部分LHX8+細胞中表達(圖3e)。

對DEGs的進一步檢查發現，ANGPT2+組中有ST18和ETV1表達。ST18和ETV1被描述為皮質小白蛋白(PV)中間神經元前體的標志物17作者假設這些細胞會在大腦發育過程中遷移到大腦皮質，并代表皮質PV中間神經元的前體。

以上結果表明，MGE中細胞分化較早，細胞譜系呈時間依賴性多樣化，Monocle370構建的偽時間分析也體現了這一點(Fig. 3g, h)。

CGE主要產生5HT3aR+皮質中間神經元。作者提取了CGE細胞，以檢查其細胞多樣性。幾乎所有的CGE細胞都高表達NR2F1和NR2F2。在這一發育階段，作者檢測了CALB2和CCK的表達，它們可能代表了成人大腦皮質中的一組雙極和多極中間神經元。然而，在作者的數據中，其他經典的CGE衍生的中間神經元標志物(如RELN和VIP)幾乎不表達。這些結果表明，在靈長類CGE中，CCK+和CALB2+的中間神經元可能比RELN+和VIP+的中間神經元更早被指定。

圖3 靈長類動物MGE發育分析

4. 細胞命運決定著LGE的發展

LGE被認為是紋狀體MSNs和嗅球中間神經元的起源。為了揭示其發育軌跡，作者從靈長類動物的合并數據中選擇了LGE譜系。在無監督聚類后，在靈長類動物發育中的LGE中檢測到7種不同的細胞類型(圖4a)。作者發現，紋狀體MSN前體可以根據FOXP1的表達分為背側LGE (dLGE)和腹側LGE (vLGE)。在dLGE中，大多數細胞是TSHZ1+紋狀體黑質(D1) MSN。在vLGE中，有兩種類型的中間神經元，紋狀體黑質(D1) MSNs表達PDYN，紋狀體蒼白球(D2) MSNs表達PENK74-76(圖4 b)。

然后作者進行了OB譜系和其他三個紋狀體譜系之間的差異基因表達分析。火山圖顯示，OB譜系細胞高水平表達干細胞相關基因，如TOX3、CHD7和ID277-79(圖4c)。對這些DEGs的基因本體分析支持嗅球中間神經元前體細胞存在于LGE的證據(圖4d)。不同時間的細胞分布表明，在人類和獼猴中，大多數OB譜系細胞都是在GE的后期階段檢測到的。這些結果表明，嗅球中間神經元前體細胞在LGE中產生的時間晚于紋狀體MSN前體細胞，然后會遷移到嗅球進一步增殖。

有趣的是，作者還發現一組細胞共享一些不同于紋狀體MSNs的MGE標記，如LHX8, NKX2-1和LHX6，以及包括ZFHX3和ISLR280的LGE標記(圖4e)。這些細胞中MEIS2的表達缺失進一步表明它們與LGE來源的細胞不同。為了弄清楚這些細胞的身份和來源，作者發現它們的特異性標記在其他典型的LGE或MGE簇中不表達(圖4e)。NRP1編碼Semaphorin信號通路中的受體Neuropilin-1。81、82個NRP1在這些細胞中集中表達，而SEMA3A主要在共表達EBF1的典型LGE MSNs中表達(圖4e)。因此，作者假設這組細胞可能來源于MGE，并在SEMA3信號通路的調控下沿著發育中的紋狀體遷移到皮質CellChat分析83(這是一種可以通過預測主要信號輸入和輸出來計算集群間細胞-細胞信號通路的工具)表明，SEMA3信號通路在LGE組中高度激活。在該通路中，SEMA3A表達細胞可能會釋放信號，并且NRP1表達細胞會對SEMA3A產生反應(圖4f)。另一個在這些細胞中高表達的基因，PEG10，引起了作者的注意。PEG10可以產生長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)和PEG10蛋白，兩者都可以促進癌細胞的遷移。之前的研究表明，MIR7-3HG作為競爭性內源RNA從microRNA27 - a -3p釋放PEG10 RNA 86MIR7-3HG在來自人類樣本的這些細胞中也高水平表達，這可能調節PEG10的表達。此外，作者下載了Sun 's group80提供的原位測序數據，并將信號轉換為圖像。在人GW12時，一組NKX2-1+和LHX8+細胞位于遠離MGE的位置。這些結果表明，一組來自MGE的LHX8+中間神經元會沿著LGE遷移，并在GE發育過程中受到SEMA3A-NRP1信號通路和MIR7-3HG-PEG10通路的調節(圖4g)。結合偽時間分析，作者對LGE的研究揭示了區域遺傳調控模型(圖4h)。

圖4 LGE發育和可能遷移細胞的特征

5. 人類基因的轉錄調控網絡

作者還對GW9的人類GE進行了scATAC-seq分析，以更詳細地研究人類發育中的GE的轉錄調控網絡。利用對scATAC-seq數據的兩次技術重復進行的單細胞分析，作者獲得了240,672個可訪問峰的一致集，這些峰代表潛在的順式調節元件。作者通過ArchR87整合了人類scATAC-seq數據和作者的GW9 scRNA-seq數據，發現兩組數據之間有4種主要的細胞類型匹配(圖5a)。作者使用基因評分，這是一種基于調控元件可及性的基因表達預測工具，在UMAP圖上將GE祖細胞、MGE、LGE和CGE的典型標記基因表達水平可視化(圖5b)。作者基于人類scRNAseq數據建立了四種主要細胞類型的標記基因列表。在標記列表中，ZNF503和LHX8是LGE和MGE譜系的代表性標記。作者在LGE中發現了ZNF503上游的兩個特異性可及基因組區域(開放染色質峰)，在MGE中發現了LHX8上游的一個獨特的峰(圖5c)。根據UCSC瀏覽器中的UCSF腦甲基化數據庫(http://genome.ucsc.edu)， LHX8的這個獨特的峰包含一個高H3K4Me3修飾區域，以及一個預測的PRX2結合位點。與ZNF503相關的兩個峰均包含預測的MEIS1靶motif, MEIS1是LGE80的標記物。這些結果提示了LHX8在MGE中的表達和ZNF503在LGE中的表達的潛在調控機制。

然后，作者使用Tu實驗室開發的方法將遠端順式調控元件連接到單個基因，從而生成基因調控網絡(GRN)，以識別候選轉錄因子(TFs)和調控因子。在捕獲的所有調控對中，作者選擇了那些都在Cytoscape88顯示的標記列表中的上游tf和下游基因(圖5d)。每一組細胞都顯示出其特定的和共享的調控網絡。例如，除了眾所周知的轉錄因子NKX2-1和LHX6, MGE還與CGE共享ARX和MEF2C，而NR2F2和NFIB則專門調控CGE的發育。LGE似乎有一個相對獨立的調控網絡，主要由ISL1、FOXP1和ZFHX4組成(圖5d)。作者基于蛋白-蛋白相互作用(PPI)從三個GE亞區中提取hub基因，得到了類似的結果(圖5e)。

接下來，作者試圖尋找可能在GE發育過程中發揮重要作用的未知基因。microRNA9-1的宿主基因MIR9-1HG(又名C1orf61)在作者的研究中脫穎而出。它參與了祖細胞和MGE的發育(圖5d)。作者通過尋找MIR9-1HG的潛在上游基因，以了解其調控機制。結合MIR9-1HG周圍開放的染色質峰和TFs的潛在結合基序，作者從8個候選TFs中選擇了3個TFs, MAZ, TCF4和ASCL1(圖5f)。有報道稱MAZ是一種轉錄激活因子結合蛋白89，這表明MAZ支持MIR9-1HG的表達。TCF4是一個參與神經分化起始的TF 90,91，其結合基序被映射到MIR9-1HG轉錄起始位點周圍的開放染色質峰(圖5)。不同細胞類型的基因表達水平之間的相關性分析顯示，在作者的數據中，在所有類型的細胞中，TCF4和MIR9-1HG之間均呈顯著正相關(圖5g)。這表明MIR9-1HG的表達受到TCF4的正調控。接下來，作者發現ASCL1結合基序位于MIR9-1HG下游的開放染色質峰，尤其是在祖細胞簇中(圖5h)。在前體細胞中，ASCL1與MIR9-1HG呈顯著負相關，而在MGE和LGE中，ASCL1與MIR9-1HG呈正相關(圖5g)。作者假設ASCL1可能抑制MIR9-1HG在祖細胞中的表達，而不是在MGE中。作者進一步檢測了MIR9-1HG潛在的下游基因。由于MIR9-1HG是一個lncRNA, microRNA9-1可以從其剪接或生成，作者在三個不同的數據庫中搜索hsa-mir-9-1的靶基因，TargetScanVert, miRDB和TargetMiner。在所有數據庫中，共有4個基因同時受到hsa-mir-9-1-3p和5p的調控。其中兩個先前被描述為LGE特異性tf, ZFHX4和ID4。這兩個基因的表達水平在MGE和LGE中均與MIR9-1HG呈顯著負相關(圖5g)。在MGE中，MIR9-1HG高表達，而ZFHX4和ID4幾乎不表達，而在LGE中基因表達模式相反。綜上所述，這些結果提出了一個新的MIR9-1HG受ASCL1和TCF4調控的調控通路。mir-9- 1hg編碼的hsa-mir-9-1可抑制ZFHX4和ID4的表達。這可能解釋了在人類早期大腦發育過程中，MGE和LGE的不同命運是如何決定的。

圖5 MGE和LGE的scATAC-seq分析和調控異質性

結論：

該研究證明了人類和食蟹猴在GEs中細胞多樣性和譜系特征的高度保守。研究者發現了人類和小鼠GE祖細胞之間的一些DEGs，并發現了靈長類GE中存在的oRGs。此外，該研究驗證了基因調控網絡在發育中的靈長類GE中的保守性，并探索了涉及不同GE區域的細胞遷移和命運決定的新機制。

參考文獻：

Zhao, Z., Zhang, D., Yang, F. et al. Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Res 32, 425–436 (2022). https://doi.org/10.1038/s41422-022-00635-9