大量的研究表明circRNAs可以通過與結合蛋白相互作用、海綿化miRNAs和調節蛋白翻譯來實現基因調控。但是circRNA是如何通過m6A修飾形成一個反饋環從而導致肝癌的機制還沒有相關文獻說明。本研究證明circGPR137B通過circGPR137B/miR-4739/FTO反饋環路抑制肝癌的發生和轉移。本研究于2022年6月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術路線：

主要研究結果：

1、  circGPR137B下調與HCC患者預后不良相關

對3對肝癌組織樣本進行了circRNA表達譜分析。與癌旁正常組織相比，熱圖顯示HCC組織中，鑒定出96個上調的circRNA和51個下調的circRNA (圖1B )。火山圖顯示，has-circ-0017114，一個來源于線性RNA GPR137B的circ RNA，在HCC中呈表達下調，命名為circGPR137B (圖1C )。circRNA圖譜和RT-qPCR顯示，與癌旁正常組織相比，HCC中circGPR137B表達降低（圖1D-1E）。預后分析發現與circGPR137B高表達組比較，circGPR137B低表達組具有較差的生存預后（圖1H-1I）。以上結果表明circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關。

圖1 circGPR137B下調與HCC患者不良預后相關

2、  circGPR137B在HCC中的特征

has-circ-0017114位于染色體14q1，由G蛋白偶聯受體137B ( GPR137B )位點第1、7外顯子區衍生而成。HepG2和Hep3B細胞在RNase R處理2h后，GPR137B的表達水平顯著下降，而circGPR137B中在HepG2和Hep3B細胞中，由于其對RNase R的抗性，circGPR137B沒有明顯的變化(圖2B )。作者隨后考察了在指定時間點暴露于轉錄抑制劑放線菌素D后，circGPR137B的穩定性。發現，在HepG2和Hep3B細胞中，circGPR137B的轉錄半衰期顯著遠長于線性GPR137B（圖2C）。qPCR和FISH分析表明，與線性GPR137B（圖2D-2E）相比，circGPR137B主要定位于HCC組織的染色細胞質中。

圖2 circGPR137B在肝癌細胞中的特征

3、  在體外，circGPR137B抑制HCC細胞的生長和侵襲

研究檢測了6株HCC細胞系中circGPR137B的表達，作者通過qRT-PCR分析，估計了circGPR137B在多個HCC細胞系中的表達情況，結果顯示，與正常肝組織相比，circGPR137B在SK-hep-1細胞系中高表達，而在HepG2和Hep3B細胞系中低表達（圖3A）。后續在SK-hep-1細胞系中進行circGPR137B的敲低實驗，在Hep3B中進行circGPR137B過表達實驗（圖3B）。MTT，集落形成和Transwell實驗顯示circGPR137B過表達HCC細胞的生長和侵襲，circGPR137B敲低則效果相反（圖3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中發揮抑癌作用。

圖3 circGPR137B抑制體外細胞生長和侵襲

4、  在HCC中miR-4739的表達和circGPR137B負相關和HCC不良預后相關

根據circRNA表達譜和miRbase數據庫鑒定， circGPR137B具有與5個miRNA結合的潛力(圖4A )，其結合位點如圖4B所示。作者們分析了hepG2細胞中5個miRNA mimics處理后的circGPR137B的熒光素酶活性，發現相比其他miRNA，miR-4739顯著降低了circGPR137B的熒光素酶活性(圖4C )。FISH分析顯示miR-4739表達水平顯著升高（圖4D-4E），且與circGPR137B呈負相關（圖4F）。TCGA數據也證實miR-4739表達在HCC中顯著上調，且和不良預后相關（圖4G-4H）。以上說明HCC中miR-4739高表達且預示不良預后。

圖4 miR-4739與circGPR137B和肝癌預后不良呈負相關

5、  circGPR137B在肝癌中充當miR-4739的海綿

在HepG2和Hep3B細胞中circGPR137B異位表達可降低miR-4739的表達(圖5B )，而miR-4739模擬物對circGPR137B的表達無影響。將野生型或變異型circGPR137B 3′UTR的PRL- TK-p MIR-Luc載體與miR-4739模擬物共轉染HepG2和Hep3B細胞，結果顯示，miR-4739 mimics降低了野生型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性，但對變異型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性沒有影響，變異型miR-4739也對HepG2和Hep3B細胞中野生型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性沒有影響（圖5C）。此外，根據一個在線循環RNA相互作用組，指出了Ago2在circGPR137B區域的占有率。RIP檢測進一步的證明，與輸入對照相比，Ago2顆粒中表達Ago2的HepG2和Hep3B下調的內源性circGPR137B和miR-4739的富集顯著提高了（圖5D）。此外，在HepG2細胞中，通過FISH分析發現circGPR137B與miR-4739之間存在胞質共定位（圖5E）。將circGPR137B慢病毒與HepG2和Hep3B細胞中的miR-4739模擬物共轉染，結果顯示miR-4739促進細胞增殖和侵襲，并抵消了circGPR137B的抑瘤作用（圖5F-5G）。

圖5 circGPR137B在肝癌中充當miR-4739的海綿

6、FTO受circGPR137B/miR?4739軸調控，提示肝癌預后良好

miR-4739模擬物可降低野生型FTO 3'UTR的熒光素酶活性，但對變異型FTO 3'UTR沒有影響，與miR-NC組相比，變異型miR-4739對HepG2和Hep3B細胞野生型FTO 3'UTR的熒光素酶活性沒有影響（圖6B）。此外，qRT-PCR和Western Blot分析表明，miR-4739模擬物顯著降低FTO、p21、p27、cleaved caspase-3/9和E-cadherin的表達，增加N-cadherin和vimentin的表達（圖6C-6D）。將FTO質粒與miR-4739模擬物共轉染HepG2和Hep3B細胞48 h后，發現FTO的異位表達阻止了細胞增殖、集落形成和細胞侵襲，逆轉了miR-4739的促瘤作用（圖6E-6G）。這些證實了m6A脫甲基化酶FTO可能是miR-4739的靶點（圖6A）。

根據RT-qPCR和Western Blot分析，與癌旁正常組織（圖7A-7B）相比，10份HCC組織樣本FTO的表達顯著降低。在50對配對和371對未配對的肝癌組織中驗證了這一結果（圖7C）。然后，作者發現FTO表達下降與HCC的年齡和遠處轉移有關。Kaplan-Meier生存分析顯示，FTO高表達組的生存率明顯高于低表達組（圖7D）。即：FTO表達在HCC組織中顯著下降，且FTO下調與HCC預后不良有關。

圖6 在HCC中，FTO受circGPR137B/miR-4739軸調控。

圖7 FTO下調提示肝癌預后不良。

7、FTO介導m6A修改circGPR137B形成一個具有circGPR137B的正反饋環

作者推測FTO介導的m6A修飾的circGPR137B可以抑制HCC的進展。MeRIP和m6A斑點雜交表明，FTO過表達降低了HepG2和Hep3B細胞的總m6A水平和circGPR137B m6A水平（圖8A-8C），但增加了circGPR137B RNA水平（圖8D）。敲除FTO可降低circGPR137B的表達（圖8E）。隨后，干擾circGPR127B使miR-4739表達增加，FTO表達下調（圖8F），反之，FTO表達增加（圖8G）。RIP實驗證實FTO可與HCC細胞中的circGPR137B結合（圖8H）。然而，FTO對GPR137B m6A水平沒有影響，不能與GPR137B結合。進一步的功能研究表明，敲低circGPR137B能夠促進HepG2和Hep3B細胞的增殖和侵襲，并抵消FTO誘導的HepG2和Hep3B細胞（圖8I-8J）的抗腫瘤作用。

圖8 FTO介導m6A修飾的circGPR137B與之形成正反饋回路

8、circGPR137B抑制體內肝癌的發生和肺轉移

將穩定轉染circGPR137B或pcDNA3.1的熒光素酶標記的HepG2細胞注射到裸鼠體內。采用活體成像檢查熒光素酶信號，結果顯示，circGPR137B組腫瘤組織的熒光素酶信號較對照組弱（圖9A）。而且circGPR137B組的腫瘤似乎比對照組小。統計學分析表明circGPR137B組腫瘤體積和重量均減小（圖9B-9C）。HE染色顯示腫瘤細胞數量減少，免疫組化分析顯示，與對照組相比，circGPR137B組Ki-67和FTO水平更低（圖9D）；qRT-PCR分析進一步顯示，與對照組相比，過表達circGPR137B組miR-4739表達降低，FTO表達升高（圖9E）。在體內阻斷circGPR137B對腫瘤生長有促進作用（圖9F）。免疫組化分析顯示，與對照組相比，sh-circGPR137B組Ki-67水平升高，FTO水平降低（圖9G）；qRT-PCR分析進一步顯示，與對照組相比，sh-circGPR137B組miR-4739表達升高，FTO表達降低（圖9H）。

采用活體成像檢查熒光素酶信號，結果顯示肝臟腫瘤生長伴腹膜轉移。circGPR137B組熒光素酶信號較對照組明顯減弱（圖10A）。circGPR137B組小鼠肝臟腫瘤的大小出現小于對照組的情況，與對照組相比，circGPR137B組小鼠體重不變但肝臟重量減輕（圖10B）。此外，尾靜脈注射穩定轉染circGPR137B或CON的HepG2細胞建立肺轉移模型。作者發現，circGPR137B組轉移性肺腫瘤的形成率較對照組肺重量減輕（圖10C）。HE染色顯示，circGPR137B組原位肝腫瘤和肺轉移瘤細胞數量減少，IHC分析顯示，circGPR137B組肝臟腫瘤和肺轉移瘤組織Ki-67指數降低，FTO表達升高（圖10D）；qRT-PCR顯示，與對照組相比，circGPR137B過表達使原位肝腫瘤miR-4739表達降低，FTO表達升高（圖10E）。綜上所述，circGPR137B能夠抑制體內肝癌的發生和肺轉移。

圖9 circGPR137B抑制體內肝癌的發生

圖10 circGPE137B抑制體內肝癌肺轉移

結論

研究結果證明，circGPR137B通過與FTO mRNA結合的miR-4739海綿誘導FTO蛋白表達，以抑制其表達。FTO蛋白進入細胞核，介導circGPR137B的m6A去甲基化，促進其表達。因此，circGPR137B產生正反饋，從而強烈抑制肝癌細胞增殖、集落形成、侵襲和肺遷移。本研究為circRNA和m6A修飾形成的反饋環路提供了直接證據，從而對表觀遺傳學產生了新的見解。

圖11 本研究的機制模擬圖

參考文獻

Liu L, Gu M, Ma J, Wang Y, Li M, Wang H, Yin X, Li X.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 21(1):149. doi: 10.1186/s12943-022-01619-4.