為探索增殖性糖尿病視網膜病變（PDR）進程中的相關免疫機制，作者通過分析GEO中兩個數據集（GSE60436和GSE102485），發現PDR和正常視網膜的纖維血管膜（FVM）中免疫細胞浸潤存在顯著差異。FVM中濾泡性輔助T細胞、M2巨噬細胞的比例顯著增加。此外，作者還發現了五個與M2巨噬細胞相關的基因，分別是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU。這些基因在PDR中高表達且可作為PDR的潛在標記物。本文于2022年5月發表在《Front Endocrinol (Lausanne) 》，IF=6.06。

技術路線圖

主要結果

1）研究設計與數據處理

如圖1所示，差異基因分析和共表達分析的綜合分析結果表明免疫細胞（特別是M2型巨噬細胞）在DR進展中發揮重要作用。進一步，FVM中的COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C, and CALU可能是PDR的潛在M2巨噬細胞相關的生物標志物。本研究選取的GSE60436數據集基于GPL6884（Illumina Humanwg-6 v3.0表達微珠芯片）的平臺，其中包括3個正常的視網膜組織和6個FVM組織。本研究的第二個數據集GPL18573基于GPL18573平臺（Illumina NextSeq 500），包含20個FVM（17例來自于2型糖尿病和3例來自于1型糖尿病患者），3個正常視網膜樣品和其他7個樣品。如圖2A所示，結果內部校正和歸一化后，消除了2個不同數據集之間的批次效應。最終，作者從兩個數據集中選擇了32個合格的樣品（6個正常視網膜和26個FVM）和14,132個交集基因進行后續分析（圖2B）。接下來，在對兩組之間的生物學差異的主要分析中，GSEA表明免疫功能的多個標志與FVM呈正相關，包括IL2-STAT5、IL6-JAK-STAT3信號通路、IFN-α、IFN-γ以及通過NF-κB傳導的TNF-α通路。其他高度富集的標志包括血管生成，凋亡和上皮間質轉變等（圖2C）。這些結果初步表明了PDR中免疫活性與FVM之間的相關性。

圖1. 流程圖展示本研究的設計過程。

圖2 數據預處理和GSEA分析。

2）FVM和正常視網膜的免疫景觀

采用CIBERSORT計算32個樣品（26個FVM和6種正常視網膜）中22種類型的免疫細胞的浸潤。箱式圖展示了29個合格樣品中22種免疫細胞類型的比例（圖3A）。圖3B展示了免疫細胞之間的相關性。其中靜止的肥大細胞和漿細胞之間表現出最強的正相關性（r = 0.6），而漿細胞和M1巨噬細胞之間的最強負相關性（r = -0.55）。兩組之間的免疫細胞浸潤比例差異如圖3C所示。與對照組相比，FVM組中濾泡輔助T細胞，M1巨噬細胞和M2巨噬細胞的百分比顯著增加，而漿細胞，活化的NK細胞和靜息肥大細胞的百分比顯著降低。如圖3D所示，FVM和正常視網膜組之間的完全分離表明，免疫細胞類型的浸潤可以用作PDR患者FVM的區別特征。

圖3. FVM和正常視網膜組織中的免疫浸潤景觀。

3）鑒定PDR浸潤免疫細胞相關基因

通過WGCNA分析基因表達數據和免疫細胞類型。如圖4A所示，作者建立了一個無標度拓撲網絡(soft-thresholding power=5, scale-free R2 = 0.9)。基于層次聚類方法，將高度共表達的基因聚類為不同的模塊和顏色編碼（圖4B）。在合并高度相關的模塊后，總共確定了28個包含14,132個基因的模塊（圖4B，C）。代表該模塊中所有基因的表達的ME與三種選定類型的免疫細胞的特征有關。其中，作者將與M2巨噬細胞最緊密相關的藍色模塊（r = 0.81，P = 1E-07）為hub模塊（圖4C，D）。該模塊包含718個基因，其中14個基因kME>0.9，被認為是hub基因，并且可能起著重要的病理學作用。GO富集分析表明這14個基因與多個富含組織重塑過程和纖維化的條目相關。生物學過程（BP），分子功能（MF）和細胞成分（CC）中的前10個重要條目如圖4E所示，包括肌動蛋白絲組織，細胞外基質組織，肌動纖維和肌動蛋白結合等。這些數據表明這些hub基因通過調節M2巨噬細胞影響PDR進展。

圖4. 通過WGCNA鑒定免疫細胞相關基因。

4）探索M2巨噬細胞相關生物標志物。

為了鑒定可能促進PDR發展的基因，作者分析了所有32個樣品的基因表達數據。對比FVM和正常視網膜組后發現674個差異表達的基因（328個上調和346個下調）（圖5A）。將差異表達和M2巨噬細胞相關的基因取交集后一共獲得5個基因，分別是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU（圖5B）。對這5個基因進行GO功能富集分析后發現，最高的GO條目劃痕愈合和組織修復等過程有關（圖5C），并且這些條目的富集與M2巨噬細胞的功能一致。此外，FVM組中這五個基因的表達顯著高于對照組（圖5D）。PCA結果顯示，整體數據集乃至單個數據集中的FVM樣品和正常視網膜樣品之間的完全分離（圖5E）。

圖5. M2巨噬細胞相關的生物標志物的鑒定。

參考文獻

Zhishang Meng, Yanzhu Chen, Wenyi Wu, Bin Yan, Yongan Meng, Youling Liang, Xiaoxi Yao, Jing Luo. Exploring the Immune Infiltration Landscape and M2 Macrophage-Related Biomarkers of Proliferative Diabetic Retinopathy. Front Endocrinol (Lausanne). 2022 May 27;13:841813. doi: 10.3389/fendo.2022.841813. eCollection 2022.