印跡位點調節劑( BORIS )的類似物在大多數癌癥中都有表達，往往與患者的短暫生存和不良預后有關。然而，其作用機制尚未闡明，也沒有已知的BORIS抑制劑。本研究堅定了一種BORIS抑制劑，強調了BORIS中ADP核糖基化的重要性，揭示了BORIS在DNA損傷修復中的新功能。本研究于2022年8月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術路線：

主要研究結果：

1.        BORIS - binding肽的特征和選擇

BORIS-N_{1 - 258}和BORIS-del N_{1 - 258}通過交替洗脫來自Ph.D.?-12噬菌體展示肽庫中富集BORIS-N_{1 - 258}結合的噬菌體克隆。BORIS-N1 – 258用來除去非特異性的噬菌體克隆，BORIS-del N1 – 258用來隨后的噬菌體克隆。經過四輪富集，洗脫的噬菌體滴度達到一定程度。然后，用BORIS-N1-258涂層板ELISA法對這9種多肽的富集噬菌體克隆進行檢測（圖1C）。噬菌體克隆9對BORIS-N1 - 258蛋白的結合親和力最高。

利用Fortebio Octet RED系統，合成多個克隆（# 9和# 2）中發現或具有高結合親和力( # 9 )的展示肽，通過生物層干涉技術( BLI )分析其與BORIS-N1 - 258蛋白的物理相互作用。BORIS-N1 - 258蛋白與生物素結合并負載到SSA傳感器上。合成的多肽用0.02 % Tween20溶解于PBS中。肽9 （肽序列為VHWDFRQWWQPS）與BORIS-N1 - 258結合，結合親和力( Kd )為86.38 μM（圖1D）。重組肽9（肽序列為RFDHWVWQSQPW）與BORIS-N1 - 258沒有任何可測的親和力（圖1E）。肽2 ( DWSSWVYRDPQT )與BORIS-N1 - 258結合，弱結合親和力( Kd )為314.5 μM （圖1F）。為了驗證相互作用，作者用生物素標記多肽9，并將其負載到SA傳感器上，用一系列濃度的BORIS-N1 - 258測定Kd值，結果是5.30 nM。

BORIS-N1 - 258抗原用于選擇從該菌中純化出的肽9。為證實肽9與人細胞中BORIS-N1 - 258的相互作用，從不表達BORIS的HEK293細胞中表達并純化了BORIS-N1 - 258。與肽9對細菌表達的BORIS抗原( Kd = 5.30nM )的親和力相比，肽9與人細胞源性BORIS-N1 - 258結合，Kd值為6.37 nM（圖 1G和 1H）。

圖1 BORIS - binding肽的特征和選擇

2. 所選擇的BTApep-TAT肽與BORIS在細胞中特異性結合

合成了多肽9與HIV - 1 TAT融合肽（肽序列為 GGRKKRRQRRRG），并用生物素標記。融合HIV- TAT肽賦予了穿透細胞膜的能力。本研究將融合HIV-1 TAT的生物素化肽9定為BTApep- TAT-biotin。合成了有生物素標記但缺乏穿透能力的肽( BTApep-biotin )來評估穿透細胞膜的效率。用含有12個連續組氨酸與HIV-1 TAT肽融合的生物素化肽作為陰性對照肽( His – TAT – biotin )。免疫共沉淀法檢測BTApep - TAT - biotin與BORIS的相互作用。BTApep- TAT-biotin與全長BORIS和BORIS-N1 - 258結合，而不能與BORIS-delN1 - 258結合（圖2A）。用siRNA ( siBORIS _ 1 )敲除H1299細胞中的BORIS后，商業BORIS抗體與BTApep- TAT-biotin肽的結合能力降低，表明BTApep-TAT能夠特異性結合細胞中的BORIS（圖2B）。

圖2 所選擇的BTApep - TAT肽與BORIS在細胞中特異性結合，誘導癌細胞DNA損傷和凋亡

3.        BTApep - TAT誘導癌細胞DNA損傷和凋亡

采用BTApep - TAT梯度稀釋法處理H1299肺癌細胞，進行MTT檢測和細胞計數。結果發現，BTApep- TAT在25 ~ 100 μM濃度下處理3天后，H1299細胞的增殖受到抑制（圖2C）。此外，BTApep- TAT抑制H1299細胞的增殖，而非正常HEK293細胞，BORIS不表達。BTApep不穿透細胞膜，不抑制細胞增殖（圖2D）。

為探討BTApep - TAT對BORIS的靶向性，采用高通量RNA測序方法比較了BTApep - TAT處理H1299細胞和2個siRNA敲除BORIS后的轉錄組細胞。BTApep - TAT處理和BORIS敲除樣本間基因表達譜的熱圖比較如圖2E所示。KEGG通路分析顯示了與1004個共同基因相關的頂端通路（圖2F）。在H1299細胞中，caspase-3/7實驗結果表明BTApep-TAT誘導細胞凋亡，TUNEL實驗結果表明BTApep-TAT引起DNA損傷（圖2G和2H）。因此，BTApep- TAT處理可能會減弱BORIS對癌細胞基因組穩定性的保護作用。

4.        BTApep - TAT抑制癌細胞中BORIS調控的DNA損傷修復

環境和內部應力，如誘變性化學物質、電離輻射( IR )、活性氧( ROS )和mis-replication 壓力，誘發DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂( SSBs )和雙鏈斷裂( DSBs )。DNA修復受損會積累DNA病變，導致基因組不穩定。DNA修復異常促進癌癥進展。即：BTApep - TAT誘導DNA損傷，減弱了BORIS對癌細胞基因組的保護作用。本研究將轉染全長BORIS或BORIS-N1 - 258的HeLa細胞的粗核提取物與含有DNA損傷的模板和對照模板的混合物進行無細胞實驗。BORIS-N1 - 258與BORIS相同程度地增強了SSBR活性（圖3A），表明BORIS的AA1 - 258N末端負責BORIS的SSBR活性。接下來，在表達BORIS的HeLa細胞的粗核提取物中加入BTApep - TAT或His - TAT （陰性對照肽）。BTApep- TAT顯著抑制SSBR和BER，而不抑制His- TAT（圖 3B和 3C）。這些結果也表明BTApep- TAT而不是His- TAT誘導癌細胞DNA損傷和凋亡（圖 2G和 2H）。

作者采用基于XhoⅠ線性化質粒的體外DNA末端連接實驗評估了BORIS和BTApep- TAT在NHEJ中的功能。相關數據表明，BORIS促進了高效的末端加入。BTApep- TAT，而非His- TAT，處理抑制了約30 % BORIS誘導的末端連接（圖3D）。BORIS-RFP轉染細胞與未轉染細胞進行DNA損傷修復的細胞百分比的比較如圖3E所示。流式細胞儀對細胞進行計數和分析?？偟膩碚f，這些實驗結果表明BORIS促進了癌細胞中SSB和DSB的修復，BTApep- TAT抑制了由BORIS控制的DNA損傷修復。

圖3 BTApep - TAT抑制癌細胞中BORIS調控的DNA損傷修復

5.        BTApep - TAT抑制BORIS的ADP核糖化來應對DNA損傷

HeLa和H1299細胞轉染C端Myc-tagged BORIS。用抗ADP-核糖抗體免疫沉淀（同時識別多聚和單聚ADP-核糖基化）表明BORIS-myc被ADP-核糖修飾（圖4A）。我們利用純化的BORIS - N1 - 258蛋白和生物素標記的PAR聚合物進行了體外ADP核糖基化實驗，證實BORIS的ADP核糖基化作用。生物素標記的PAR與BORIS - N1 - 258在體外呈濃度依賴性結合（圖4B）。然后用抗ADP核糖抗體對轉染BORIS-N1 - 258 - myc的H1299細胞進行免疫沉淀，證實了BORIS-N1 - 258 - myc的修飾作用。BORIS-N1 - 258 - myc的ADP核糖基化水平與全長BORIS ( BORIS-myc )相當（圖4C）。這些結果證明了BORIS在氨基酸1 ~ 258中ADP核糖基化。

其次，研究了DNA損傷條件下BORIS的ADP核糖基化水平。合成雙鏈DNA ( dsDNA )用于模擬DNA損傷細胞中的DNA斷裂。將合成的dsDNA加入到BORIS表達細胞的裂解液中，檢測其ADP核糖基化水平，發現dsDNA能促進BORIS在HeLa和H1299細胞中的ADP核糖基化（圖4D）。此外，IR（照射）輕微誘導BORIS的ADP核糖基化（圖4E），H2O2誘導BORIS的ADP核糖基化相當大（圖4F）。X射線照射產生的SSB比DSB多25倍。這些結果提示dsDNA或ssDNA誘導BORIS發生ADP-核糖基化的幅度存在差異。雖然ssDNA和dsDNA均促進了BORIS的ADP核糖基化，但dsDNA的誘導作用強于ssDNA （圖4G）。

將純化的BORIS-N1 - 258蛋白分別與25 μM和50 μM的BTApep- TAT或His- TAT預孵育后進行體外ADP核糖基化實驗，發現BTApep- TAT能有效抑制BORIS-N1 - 258的ADP核糖基化（圖4H）。轉染H1299細胞的BORIS-myc的修飾也被25 μM BTApep- TAT處理而不被His- TAT處理所抑制（圖4I）。這些結果表明，BTApep- TAT無論在體外還是在體內都明顯抑制了BORIS的ADP核糖基化。

圖4 BTApep - TAT抑制BORIS的ADP核糖化來應對DNA損傷

6.        BTApep - TAT抑制BORIS 第198 - 228位的ADP核糖基化，阻斷了BORIS與Ku70的相互作用

假設BORIS-N1 - 258的功能需要ADP核糖基化，為了確定BORIS中ADP核糖基化的位點，作者制作了幾個截斷突變體。缺失AA2 - 227產生了與AA228 - 663相對應的截短BORIS蛋白，與缺失AA2 - 197產生的AA 198 - 663 BORIS相比，該截短產物ADP核糖基化明顯減少。這一觀察表明，改性的主要位點位于殘留物198 – 228（圖 5A和 B）之間。已知谷氨酸近端序列為ADP核糖基化。利用ADPredict軟件進行區域和站點的預測BORIS的N個區域，谷氨酸殘基198、204、214、225和226是推測的ADP核糖基化位點，在小鼠、大鼠和人類中進化保守（圖5B）。因此，將該區域內的5個谷氨酸( E )殘基全部替換為丙氨酸殘基( A )，產生了BORIS的五元組突變體( 5EA )（圖5B）。5EA突變降低了BORIS的ADP核糖基化（圖5C）。雖然5EA突變并未完全取消BORIS的ADP核糖基化，但觀察到明顯下降。BORISN1 - 258內另外兩個潛在的ADP-核糖基化區( AA 29 - 33和 AA 165 - 185 )也通過丙氨酸殘基替換谷氨酸殘基而發生突變；然而，這些突變并沒有減弱ADP核糖基化（圖5D）。如圖5C和D所示，5EA突變體降低了表觀分子量，而E29 - 33A或E165 - 185突變體降低不明顯。

BORIS-N198 - 228肽的多聚ADP核糖基化與其豐度成比例累積（圖5E）。BORIS-5EA在體內照射或體外DNA連接實驗中對DNA修復無活性（圖5F-G）。當細胞與BTApep- TAT孵育后，BORIS與Ku70的相互作用被阻斷（圖5H）。BORIS - 5EA僅與Ku70弱相互作用，表明BORIS與Ku70結合需要ADP核糖基化（圖5I）。綜上所述，BORIS的ADP核糖基化與Ku70和DNA修復有關。BTApep- TAT通過干擾BORIS的ADP核糖基化及隨后與Ku70的相互作用，減弱了BORIS在DNA損傷修復中的功能。

圖5 BTApep - TAT抑制BORIS 198 - 228位點的ADP核糖基化，阻斷了BORIS與Ku70的相互作用

7.        BTApep - TAT可抑制皮下腫瘤的進展

為了驗證BTApep - TAT在體內的功能，本研究利用體外對BTApep - TAT敏感的H1299細胞，建立NOD / SCID / γ c null ( NSG )小鼠移植瘤模型。12只小鼠前肢皮下注射H1299細胞（1×106/只）。1周后，將小鼠分為2組（每組6只），隔天腹腔注射16mg / kg BTApep- TAT或His- TAT，連續3周。隔日對腫瘤進行評估。安樂死和腫瘤切除后，于實驗結束時測量腫瘤重量（圖6A）。與His- TAT治療相比，BTApep- TAT抑制腫瘤生長（圖6B）。此外，BTApep - TAT處理未引起肝、腎毒性（圖6C）。腫瘤切片檢查采用TUNEL法。用BTApep- TAT治療3周，而不用His- TAT，誘導皮下腫瘤細胞DNA損傷（圖6D）。

圖6 BTApep - TAT可抑制皮下腫瘤的進展

結論

本研究表明BTApep- TAT肽可以靶向BORIS。BTApep - TAT與BORIS相互作用，抑制BORIS相關轉錄組，模擬BORIS敲減的效應。BTApep- TAT抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，抑制移植瘤模型中NSCLC進展，抑制BORIS的ADP核糖基化。BORIS在198 - 228殘基上的ADP核糖基化促進了與Ku70的相互作用，并負責DNA修復。研究結果表明了BTApep- TAT肽用于癌癥治療的可行性，為今后深入剖析BORIS的調控機制和設計優化的BORIS抑制劑提供了依據。

參考文獻

Zhang Y, Fang M, Li S, Xu H, Ren J, Tu L, Zuo B, Yao W, Liang G.(2022) BTApep-TAT peptide inhibits ADP-ribosylation of BORIS to induce DNA damage in cancer. Mol Cancer. 21(1):158. doi: 10.1186/s12943-022-01621-w.