選擇性RNA剪接是最重要的轉錄后基因調控機制之一，有助于真核生物蛋白質多樣性的形成，其失調是腫瘤發病的一個關鍵機制。近日，有作者系統地研究了肺腺癌（LUAD）的RNA剪接改變，并揭示了它們的生物學和臨床意義，為開發LUAD的剪接轉換療法奠定了基礎。該研究發表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：38.104。

技術路線：

主要研究結果：

1. LUAD中異常交替剪接事件的識別與統計

為了系統地揭示LUAD中的異常可變剪接事件（AASEs），作者收集了兩個數據集。一種是他們的綜合隊列，包括285個腫瘤樣本和145對高質量的癌旁樣本。另一個是TCGA-LUAD隊列，包括514例腫瘤和59例癌旁樣本。主成分分析顯示，作者的整合隊列的腫瘤和鄰接正常樣本明顯被分為兩組（圖1a），說明測序數據質量一致。基于這兩個隊列，確定了28774個選擇性剪接事件（ASEs），它們影響8,726個基因，包括用于治療肺癌的酪氨酸激酶抑制劑的靶點（如EGFR、RET和MET） （圖1b）。這一結果支持了選擇性剪接模式可能改變LUAD患者的藥物反應的可能性。在該研究中，鑒定了7種不同類型的ASEs，包括保留內含子（RI）、相互排斥的外顯子（ME）、外顯子跳躍（ES）、交替終止子（AT）、交替啟動子（AP）、交替受體位點（AA）和交替供體位點（AD）（圖1c）。

此外，作者確定了影響2081個基因的3688個AASEs，其中AP和ES事件占絕大多數（圖1d）。雖然一些基因同時受到多種類型（最多3種）AASEs的影響，但大多數基因只受一種類型AASEs的調節（圖1e）。在LUAD患者中，7種AASEs的比例相似，大多數患者包含超過2,000種AASEs（圖1f）。在這3688個AASEs中，有1670個AASEs在TCGA LUAD隊列中也顯著異常，且其中97%（1620/1670）在兩個隊列中具有相同的上調或下調方向，這表明作者發現的AASEs是穩健的。

在受AASEs影響的2081個基因中，有1981個基因屬于蛋白質編碼基因，表明AASEs對編碼基因有明顯的影響，可能對LUAD產生重大影響。此外，大多數AASEs至少在75%的LUAD樣本中被鑒定出來（圖1g），這意味著以AASEs為靶點的治療可能會使許多LUAD患者受益。與相鄰正常組織相比，LUAD中NUMB跳變外顯子（NUMB PRRL）的包含量顯著增加（圖1h）。western blotting實驗進一步驗證了LUAD樣品中NUMB PRRL / NUMB PRRS比值顯著升高（圖1i）。此外，生存分析顯示，較高的NUMB PRRL / NUMB PRRS比值表明較差的總生存（OS）（圖1j）。這些結果提示，NUMB的異常選擇性剪接可能是LUAD惡性的原因之一。未來需要進一步研究該AASE在LUAD中的分子機制和干預價值。

圖1 LUAD中異常可變剪接事件（AASEs）及其相關基因概述

2. RNA結合蛋白（RBPs）對LUAD中AASEs的調控模式

ASAS最常見的調節因子之一是RBP, RBP的干擾會導致廣泛的ASAS。作者檢測到了100個差異表達的RBP，其中68個RBP在LUAD中表達上調，32個RBP表達下調（補充表2），即RBP在癌癥中傾向于上調。此外， 88個差異表達的RBP與2505個AASES顯著相關，產生了46704對RBP-ASE。約一半（47%）（2228 /46704）對為負相關（RBP水平越高，對應的替代外顯子的包含水平越低），另一半為正相關，表明RBPS對AASES的調控在整體上是平衡的。基于RBPS和AASES之間的顯著相關性建立了失調網絡圖。該網絡表明，受差異表達RBP影響的AASES相關基因富集于腫瘤發生的關鍵過程和通路，如“RAS蛋白信號轉導”、“NF - Κ B信號通路”、“WNT信號通路”，以及侵襲和轉移的關鍵過程和通路，如“細胞-基質黏附”和“肌動蛋白絲運動”（圖2A），提示這些差異表達的RBP通過引起LUAD的剪接改變在腫瘤發展中起關鍵作用。每個RBP調節的AASES數量在很大程度上是不同的，ALDH18A1、PDIA4和NUSAP1是調節AASES數量最多的RBP（圖2B）。

為了測量AASE調節的RBP對LUAD中藥物的影響，檢測在LUAD細胞系中具有最高調節能力的前20個RBP的表達和藥物活性之間的相關性。結果發現肺腺癌中4個上調的RBP與藥物敏感性相關。其中，DARS2基因與CMK和PHA-665752藥物的IC50值呈正相關，CNOT11基因與小白菊內酯和SELICICLIB藥物的IC50值呈正相關，提示這些藥物的作用可能被DARS2和CNOT11在LUAD中的高表達所抑制。此外，DKC1基因與GSK319347A （TBK1和IKKΕ的雙重抑制劑）的IC50值呈負相關，PDIA4基因與PYRIMETHAMINE（具有抗癌和免疫刺激作用的STAT3抑制劑）的IC50值呈負相關24，這提示DKC1和PDIA4在LUAD中的高表達可能分別增加GSK319347A和PYRIMETHAMINE的敏感性（圖2C, D）。

圖2 RNA結合蛋白（RBPs）對AASEs的調控

為了直接調控ASEs，大多數RBP必須與剪接位點附近相應的基序結合。基于DeepBind的結果和顯著的RBP-ASE對，作者構建了一個更穩健但更小的失調網絡。該網絡反映了三個RBP介導了LUAD中的438個AASEs，其中AT、AP和ES占最多（圖3a）。在這些RBPs中，IGF2BP3介導的AASEs數量最多，受這些AASEs影響的基因在腫瘤侵襲轉移過程中富集，如"細胞外基質組織"、"細胞連接組織"和"細胞-基質黏附"。由KHDRBS2調節的AASEs也在類似的生物學過程中富集（圖3b）。作者對差異盒外顯子兩側的轉錄序列進行基序掃描分析，并與非差異盒外顯子進行比較。這些分析表明，IGF2BP3的保守結合基序在上游和下游剪接位點附近150 bp的上調的盒外顯子區域和內含子區域中顯著地過度表達。IGF2BP3保守的結合基序也在下調的盒外顯子上游150-300 bp的內含子區域中顯著過度表達（圖3c）。對于KHDRBS2，結合基序顯著富集于下調的盒外顯子上游約150-300 bp的內含子區域，以及上調的盒外顯子下游約150-300 bp的內含子區域（圖3d）。作者還觀察到YBX2結合基序在上調外顯子內以及上調外顯子下游約150 bp處顯著富集。YBX2的保守結合基序也顯著地在下調的盒外顯子下游約0-150 bp的內含子區域中過度表達（圖3e）。因此，基序搜索分析進一步證實了這三個RBP對AASEs的調控作用。綜上所述，這些結果全面揭示了RBPs在肺腺癌中對AASEs的調控作用，提示RBPs干擾了肺腺癌中具有關鍵功能意義的選擇性剪接譜，并為開發新的治療策略提供了重要信息。

圖3 RBP對AASEs的更強調控作用

3. LUAD中AASEs的DNA突變和甲基化調控模式

據報道，DNA突變也可能通過改變調節RNA序列、RBP結構或其他調節分子來影響ASEs。對ASEs具有調控作用的單核苷酸變異（SNV）被稱為剪接數量性狀位點（sQTL）。該文應用MatrixEQTL算法在LUAD中發現sQTL。一般來說，如果調控SNV在其相應的剪接位點附近100 Kbp范圍內，這個SNV被定義為cis-sQTL;否則，它是反式sQTL。因此，只發現了1個順式sQTL，其中TP53剪接位點的突變會增加外顯子10的包含水平（圖4a）。還發現36個反式sQTL在肺腺癌中調節廣泛的ASEs。在LUAD中，trans-sQTLs不規則地定位于染色體上。trans-sQTL調控chr1上的200多個酶，而調控chr13、chr18和chr21上的不到50個酶（圖4b）。這些結果全面揭示了sQTLs的模式，并幫助更好地理解肺腺癌復雜的遺傳結構。

除了DNA突變之外，表觀基因組學研究還揭示，DNA甲基化可能通過甲基化-CpG結合蛋白2和異染色質蛋白在剪接調控中發揮作用。為了研究AASEs是否部分由DNA甲基化水平紊亂引起，首先在可變剪接外顯子邊界處確定了1980個CpG位點（圖4c）。將CpG位點在肺腺癌和癌旁正常組織之間進行比較后，確定了56個具有差異甲基化水平的CpG位點（圖4d）。然后研究了這些差異甲基化的CpG位點對其對應的AASEs的調控作用，發現21個CpG位點與AASEs顯著相關。除了一個CpG位點外，所有這些CpG位點都與其對應的AASEs呈負相關，并且這些AASEs都屬于AP （alternative promoter，也稱為alternative first exons）（圖4e）。也就是說，替代第一外顯子邊界附近的CpG位點甲基化水平越高，替代啟動子的使用率越低。為了研究這一規律是否在癌癥中普遍存在，接著分析了30種其他類型癌癥中CpG位點及其對應的ASEs之間的關系。結果發現，受CpG位點調控的ASEs絕大多數是AP事件（圖4f），大部分AP事件的包含水平與相應CpG位點的甲基化水平呈負相關（圖4g）。此外，對AP事件具有調控作用的CpG位點大多位于啟動子區域，少部分位于基因體區域（圖4h）。所有這些結果表明，DNA甲基化對ASEs在腫瘤中的主要作用是抑制替代啟動子的使用。

圖4 LUAD中DNA突變和甲基化對AASE的調控模式

4. AASEs在LUAD中的功能意義

在本研究中，受AASEs影響的2081個基因中，大多數在轉錄水平和蛋白質水平都有不同的亞型。這些結果表明，這些基因的異常剪接可能導致相當大的功能變化（圖5a）。為了進一步揭示AASEs對肺腺癌的生物學作用，對受AASEs影響的基因進行了基因本體論（GO）富集分析。結果發現，在7種類型的ASEs中，只有受異常AP和ES事件影響的基因在癌癥相關的GO術語中顯著富集。異常的AP事件主要影響促進腫瘤增殖的通路：“小GTP酶介導的信號轉導”，如“Ras信號通路”和“Rho信號通路”。異常ES事件主要影響與腫瘤轉移相關的生物學過程，如“纖毛組裝”、“細胞連接組織”和“細胞-基質黏附”（圖5b）。為了更深入地研究AASEs的功能意義，通過單樣本基因集富集分析（ssGSEA）方法測量了14個腫瘤標記物的活化程度，并研究了AASEs與這些標記物活化程度之間的關系。AASEs影響最多的標記為“TGF β信號通路”、“細胞信號傳導”、“細胞周期過程”和“Ras信號通路”。然而，“EMT過程”和“前體代謝物和能量的生成”幾乎沒有受到影響（圖5c）。進一步研究與癌癥特征相關的AASEs所富集的生物學過程，并利用蜂巢圖展示了AASEs（左軸）如何與癌癥特征（中軸）相關，以及受這些AASEs影響的基因（右軸）的功能富集。作者發現與許多標志相關的AASEs也在“細胞-基質連接組裝”和“細胞-基質黏附”中顯著富集（圖5d）。這些結果進一步表明，肺腺癌中的AASEs在與腫瘤增殖和轉移相關的生物學過程中具有實質性的功能意義。

圖5 AASEs的功能含義

5. 基于AASEs的LUAD亞型分類具有明顯的生物學特征

基于RNA剪接模式的分子分型已被證明可對其他腫瘤類型中具有不同預后或治療效果的患者進行分層，因此可用于改善LUAD的患者分層。基于3688個AASEs，通過共識聚類分析將514個TCGA LUAD樣本分為3個亞型:G1 （n = 176, 34.2%）， G2 （n = 130, 25.3%）和G3 （n = 208, 40.5%）。與G1和G2相比，G3的AASEs總數（AASEs頻率）最高（圖6a）。7種AASEs在3種亞型中的比例相似（圖6b），此外，AASEs頻率高表明肺腺癌中免疫細胞浸潤程度高，預后好（圖6c, d）。LUAD的三個AASE亞型具有特定的AASE特征和模式。例如，TRIM7、MLK4、ADNP和TRAP1等腫瘤相關基因的AP事件在G1中包含量較高。腫瘤相關基因如DDX17、PLCB2、SEMA6C的AASEs在G2中包含量較高。而腫瘤相關基因如ARMC3、TPM4和TNFRSF12A的AASEs在G3中包含量較高（圖6e）。

進一步研究了這三種亞型的生物學特性，發現G1是一個快速增殖的亞型，富集的通路有“細胞周期”、“DNA修復”、“DNA復制”等（圖6f）。G1也是一個高代謝亞型，通路富集在“氧化磷酸化”、“葡萄糖代謝”、“蛋白質代謝”、“核苷酸代謝”等（圖6f），提示G1可能從傳統的靶向高增殖細胞的化療中獲益更多。G3具有特定的代謝模式，其特征是偏好脂肪酸代謝（圖6f）。此外，G3是一個具有高細胞黏附分子、高PD1信號（圖6f）和低干性指數、低端粒酶活性（圖6g）的亞型。此外，在CpG島啟動子區域收集了719個用于鑒定LUAD甲基化亞型的最可變的DNA甲基化特異性探針，根據這些探針，G2為高甲基化，而G3為低甲基化（圖6h, i）。

圖6三種LUAD亞型的AASEs及其生物學特性

6. AASE亞型LUAD具有明顯的免疫特性

由于AASEs頻率與免疫細胞浸潤水平呈正相關，進一步深入表征了AASEs亞型的免疫特征。首先，評估并比較了三種亞型中22種免疫細胞的浸潤水平。結果顯示，11種細胞類型顯示出顯著差異，包括7種固有免疫細胞和4種適應性免疫細胞（圖7a）。大多數細胞類型在G3亞型中表現出最高的浸潤水平，例如CD4 +記憶靜息T細胞和髓樣樹突狀細胞（圖7b）。所有免疫細胞的浸潤水平在G3中也是最高的（圖7c）。

通過ssGSEA分析量化了每個腫瘤樣本中17條免疫通路的激活程度，發現有16條通路在3種亞型中表現出顯著差異（圖7d）。許多對抑制腫瘤生長至關重要的免疫通路在G3中持續上調，如“抗原處理和呈遞”、“NK細胞細胞毒性”和“TCR信號通路”（圖7e）。與免疫細胞的浸潤水平一致，腫瘤微環境中所有免疫通路的激活水平在G3中最高（圖7f）。

為了使免疫微環境的評估更加全面，進一步檢測了每個腫瘤中的78種免疫調節劑，發現19種免疫調節劑的表達水平在3種亞型之間存在顯著差異（圖7g）。大多數差異表達的免疫調節劑在G3亞型中最高，包括重要的共刺激分子（CD28和CD80）和抗原呈遞基因（HLA-DPA1和HLA-DRA）（圖7h）。G3中78種免疫調節劑的總表達量也是最高的（圖7i）。HE染色顯示，G3中浸潤的免疫細胞比例最高，提示G3確實是“熱”腫瘤（圖7j, k）。IHC染色和組織評分（H-score）分析發現，CD8和PD-L1是免疫治療療效的關鍵免疫標志物和預測因子，在G3中最高（圖7j, k）。

圖7 LUAD AASE亞型的免疫特性

7. LUAD AASE亞型的臨床意義

免疫原性微環境意味著良好的預后和對免疫檢查點阻斷劑的良好應答率。由于G3亞型的免疫浸潤始終較高，其G3級預后最好，可作為獨立預后因素（圖8a）。此外，這三種LUAD亞型對靶向不同通路的不同藥物敏感，但它們都對HSP抑制劑敏感，如AT-13387和諾米林（圖8b）。通過細胞增殖實驗，證實兩種藥物均能顯著抑制肺腺癌細胞株A549、NCI-H2347、NCI-H441的增殖（圖8c），且這兩種藥物對細胞生長的影響通過集落形成實驗進一步證實（圖8d）。這些結果一致表明，AASE亞型不僅可以反映腫瘤實質的轉錄組學特征，而且可以反映腫瘤免疫微環境。

圖8 LUAD AASE亞型的臨床意義

結論：

總之，改研究系統地研究了AASEs在LUAD中的應用，并從多個角度揭示了AASEs及其調控因子的生物學相關性。闡明了剪接調控異常對腫瘤免疫微環境的影響，為設計LUAD的剪接切換治療方法奠定了基礎，有助于進一步認識LUAD的分子特征，促進LUAD的基礎研究和精準醫療。