環狀RNA(circRNAs)在參與各種生物過程和參考多種疾病方面受到越來越多的關注。雖然阿爾茨海默癥(AD)中差異表達的circRNA已經建立，但與AD直接相關的關鍵circRNA在基因表達和疾病相關認知中的精確特征和功能尚不清楚。在此，作者篩選并鑒定了circCwc27這一與AD相關的新型circRNA。該研究于2022年2月發表在《Cell Death Differentiation》，IF：10.717。

技術路線：

主要研究結果：

1. CircCwc27在AD中上調

作者的目標是篩選AD早期有希望的circRNA，收集6月齡的APP/PS1轉基因和WT對照小鼠海馬體。共有131個circRNA顯著失調，熱圖中顯示了上調和下調最高的15個circRNA(圖1A)。在這30個circRNA中，Rybak-Wolf等人鑒定出13個在人和小鼠之間保守的circRNA。APP/PS1小鼠和WT小鼠的海馬體比較中，有4個circRNA顯著上調，4個circRNA顯著下調(圖1B)。在APP/PS1小鼠的海馬區觀察到AD患者的顳葉皮質和血漿中檢測到circCwc27(mmu_circ_0004423)明顯升高(圖1C)，并且在海馬區表達量最高(圖1D)。

2. CircCwc27是一個豐富、穩定的circRNA，主要定位于神經元的細胞質中

在大腦皮層和海馬體中觀察到circCwc27高度表達，這是大腦中兩個脆弱的區域(圖1E)。此外，在APP/PS1小鼠和WT小鼠的大腦中，circCwc27主要表達在神經元而非神經膠質細胞中(圖1F和G)。同時檢測了circCwc27的絕對拷貝數，結果顯示，每個人的海馬神經元中平均有98個circCwc27拷貝，SH-SY5Y細胞中有78個circCwc27拷貝(圖1H)。

圖1. CircCwc27是一個高度豐富且穩定的circRNA，在AD中表達上調

3. 在APP/PS1小鼠中敲除circCwc27可改善兒童的認知能力下降

將表達shRNA circCon-GFP(LV-sh-circCon)或shRNA circCwc27-GFP(LV-sh-circCwc27)的慢病毒微注射到9月齡小鼠側腦室，2個月后分析小鼠的記憶和空間學習能力(圖2A)。綠色熒光蛋白(GFP)信號主要分布在整個皮層和海馬區，并與神經元共定位(圖2B和C)。CircCwc27表達顯著下調，慢病毒轉導后Cwc27水平保持不變(圖2D)。Y迷宮自發交替行為測試顯示APP/PS1小鼠微注射LV-sh-circCon后，交替性明顯下降，而抑制circCwc27則能顯著阻止這種下降(圖2E)。組間相同的條目數不支持運動功能缺損(圖2F)。

在訓練階段，APP/PS1小鼠中微注射LV-sh-circCon，發現隱藏平臺的潛伏期明顯延長，而微注射LV-sh-circCwc27提高了學習能力(圖2G和H)。在探針試驗中，記憶保持是通過在包含隱藏平臺的象限所花費的時間來衡量的。結果表明，下調circCwc27可以改善APP/PS1小鼠的空間記憶(圖2I和K)。另外，所有組小鼠的游泳速度都相似(圖2J)。綜上所述，這些數據表明，敲除circCwc27在很大程度上改善了AD的認知衰退。

圖2. 在APP/PS1小鼠模型中敲除circCwc27可改善空間學習記憶

4. 在APP/PS1小鼠中，下調circCwc27可防止Aβ沉積及相關神經退行性影響

應用Aβ抗體(NAB228)對APP/PS1小鼠腦組織進行染色，結果顯示微注射LV-sh-circCwc27明顯降低了斑塊負荷(圖3A)。注射LV-sh-circCwc27后，大腦皮層和海馬區可溶性和不可溶性Aβ40和Aβ42水平均持續下降(圖3B-E)。此外，觀察到circCwc27的表達與APP/PS1小鼠組Aβ40(圖3F)或Aβ42水平(圖3G)成正相關。在小鼠海馬中微注射LV-sh-circCwc27，Aβ與營養不良神經細胞共定位的區域顯著減少(圖3H)。WT小鼠微注射LV-sh-circCwc27不影響突觸相關蛋白的表達，而APP/PS1小鼠明顯抑制其下降(圖3I)。APP/PS1小鼠微注射LV-sh-circCwc27可顯著降低小膠質細胞和星形膠質細胞的活化(圖3J)。上述結果表明，circCwc27基因的下調在AD的神經炎癥和神經退行性作用中發揮了保護作用。

圖3. 敲除circCwc27可改善APP/PS1小鼠的AD病理

5. CircCwc27直接與Pur-α蛋白結合并影響其分布

下一步的目標是闡明circCwc27引起AD病理的分子機制。通過RNA免疫沉淀(RIP)，觀察到內源性circCwc27沒有在AGO2上富集(圖4A)。因此，進行RNA下拉分析和質譜(MS)分析，在APP/PS1小鼠海馬中尋找潛在的circCwc27相互作用的蛋白(圖4B)。共有154個蛋白被circCwc27連接探針拉下，這些蛋白大多在大腦中富集。GO富集分析顯示，這些蛋白大多與RNA/DNA結合相關(圖4C)。

RIP檢測結果表明，Pur-α抗體和HNRNPK抗體可拉低circCwc27，而不是SH-SY5Y細胞中的其他三個候選者(圖4D)。RNA下拉結果也驗證了circCwc27與Pur-α的直接相互作用(圖4E)。再進一步驗證了circCwc27與Pur-α的內源性共定位(圖4F)。RIP檢測結果顯示，與circCwc27直接結合的只有PUR重復結構域(66-246aa)，沒有其他結構域(圖4G)。

與WT小鼠相比，APP/PS1和APP/PS1-LV-sh-circCon小鼠海馬區circCwc27介導的Pur-α水平顯著上調(圖4H)。敲除circCwc27在APP/PS1小鼠能顯著降低circCwc27與Pur-α的結合(圖4H)。在RIP測定中也得到了類似的結果(圖4I)。免疫印跡結果顯示，APP/PS1小鼠細胞核Pur-α表達明顯降低，胞漿Pur-α表達增加(圖4J和K)。注射LV-sh-circCwc27可顯著促進Pur-α的核分布(圖4J和K)。總之，結果表明，增加circCwc27與Pur-α相互作用并將其捕獲在細胞質中，而敲除circCwc27可促進Pur-α的核轉位。

圖4. CircCwc27與Pur-α蛋白相互作用并影響其分布

6. Pur-α降低Aβ負荷，防止AD患者認知能力下降

將攜帶Flag-labeled Control-GFP(Flag-AAV9-Control)或Pur-α(Flag-AAV9-Pur-α)的腺相關病毒制劑微注射到APP/PS1小鼠海馬中，觀察Pur-α對AD病理的影響。立體定向注射兩個月后，海馬區出現明顯的綠色熒光和約42 kDa的Flag表達，表明有效的信號轉導(圖5A-C)。值得注意的是，在Pur-α過表達的大腦中，circCwc27的表達沒有變化(圖5D)。與對照組相比，過表達Pur-α可顯著減少APP/PS1小鼠海馬區Aβ沉積和促炎細胞因子(圖5E和F)。微注射Flag-AAV9-Pur-α在很大程度上保護APP/PS1小鼠的記憶形成嚴重缺陷(圖5G-I)。綜上所述，這些結果表明Pur-α可以減少Aβ沉積，挽救空間記憶損傷。

圖5. Pur-α減少Aβ沉積，防止AD認知能力下降

7. CircCwc27通過與Pur-α結合調控AD基因的轉錄

對微注射LV-sh-circCon和LV-sh-circCwc27的APP/PS1小鼠海馬區進行了RNA測序，鑒定出339個差異表達基因(圖6A)。此外，學習和記憶基因富集顯著上調(圖6B-D)。在APP/PS1小鼠和AD患者中，大部分circCwc27調控的基因表達都發生了改變(圖6E和F)。ChIP-qPCR驗證了Pur-α直接結合到由circCwc27控制的AD異常基因的啟動子上(圖6G)。通過敲除circCwc27，Pur-α與這些基因啟動子的結合降低被逆轉(圖6H)。總之，circCwc27通過與Pur-α結合，減少了Pur-α對AD相關基因啟動子的招募。

圖6. CircCwc27通過與Pur-α結合調控AD基因的轉錄

結論：

總之，作者的研究結果表明，circRNA-蛋白相互作用的重要功能結果，即circCwc27通過與調控蛋白Pur-α結合，可能在AD發病過程中發揮關鍵作用，并代表了一個具有臨床轉化潛力的AD治療靶點。