骨髓細胞是肝硬化的關鍵調節因子，肝硬化是世界范圍內導致死亡的主要原因。由于基質細胞在體外可以調節髓系細胞的功能，所以靶向基質-髓系相互作用已成為一種有吸引力的潛在治療策略。本研究的目的是探討人肝基質細胞如何影響骨髓細胞特性，并了解基質-骨髓共培養系統這些相互作用在肝硬化背景下的效用。本研究最終揭示肝基質細胞可通過釋放IL-6調節巨噬細胞的成熟和分化。本研究于20022年1月發表在《JOURNAL OF HEPATOLOGY》IF：30.083期刊上。

技術路線

主要實驗結果

1、肝硬化和非肝硬化細胞的單細胞圖譜揭示差異細胞群

作者通過兩種方法研究了肝基質細胞如何調節骨髓細胞表型，以及體外基質-骨髓系統研究人類肝硬化的相關性。如圖1A，對肝基質細胞和骨髓細胞進行單細胞測序；使用原代人基質-髓系共培養系統來研究肝基質細胞如何影響CD14 +細胞的成熟和分化。單細胞測序對骨髓譜系特征的集中分析顯示有5個主要的細胞群：血源性單核細胞（Mono1），CD16 +單核細胞（Mono2），KCs，SAM和髓源性樹突狀細胞（mDC）（圖1B）。髓系細胞亞群的分類使用的是關鍵基因標志物（圖1B-C），Mono1表達血源性單核基因CD14，LYZ，S100A9，S100A8；Mono2表達CD16陽性單核基因FCGR3A，TIMP1，CD52；KC細胞表達C1QC，CD163，CTSB，FCGR3A；SAM細胞表達TREM2，CD9，FABP5，SPP1，mDC細胞低表達CD14和上調的CD1C及CLEC10A。總之，肝硬化和非肝硬化細胞的單細胞圖譜已經具有明顯不同。

2、CD14⁺細胞HLA-DR上調提示巨噬細胞成熟

為單細胞測序結果的髓系細胞群生成基因特征，并使用DWLS方法估計了這些細胞群在培養的CD14+細胞中的相對豐度（圖1D）。如預期的，在共培養0h時，以Mono1亞群為主，然而，72h后，CD14+細胞向巨噬細胞亞群的表達譜轉變，如KCs和SAM。轉錄組測序的結果支持這一結論（圖1E）。這些結果表明共培養72小時后單核細胞向巨噬細胞轉化。

由于巨噬細胞比單核細胞更適合呈遞抗原，所以作者檢測了HLA-DR的表達以區分人類巨噬細胞和單核細胞。結果顯示和單核細胞亞群比較（Mono1和Mono1），HLA-DR的表達在巨噬細胞亞群（KCs和SAM）中上調（圖1F）。轉錄組測序也證實CD14+細胞培養72h后HLA-DR的表達顯著上調（圖1G-H）。研究發現培養72小時的細胞基因主要富集在Antigen processing and presentation via MHC class II的GO條目中。因此，這些結果表明HLA-DR的表達可鑒定巨噬細胞并且提示CD14+細胞向HLA-DR巨噬細胞成熟在培養72小時后。

圖1人CD14⁺細胞HLA-DR上調提示巨噬細胞成熟

3、基質細胞限制人單核細胞向巨噬細胞成熟

為了研究基質細胞對巨噬細胞成熟的影響，采用了人基質-髓系共培養系統，將原代肝基質細胞與新鮮分離的血液CD14+細胞共培養0-72小時（圖2A）。基質細胞顯著降低了CD14+細胞向巨噬細胞的轉化（圖2B）。轉錄組測序的結果也支持這一結論（圖2C）。這些表明原代肝臟基質細胞在體外限制單核細胞向巨噬細胞成熟的轉變。

4、培養的基質細胞在轉錄上類似于原纖維間充質細胞亞群 Mes-2

為了區分哪個肝基質細胞亞群在體外限制巨噬細胞成熟，作者比較了通過 單細胞測序的離體肝基質細胞的轉錄組和通過批量 RNA-seq 的體外原代肝基質細胞。亞聚類分析顯示了14種非造血細胞亞群，如圖2D-2F所示，每種類群根據區基因標志物的特異性表達區分。使用 DWLS 分析將 scRNA-seq 亞群與體外基質細胞的轉錄比對確定間充質細胞亞群 Mes-2 為主要亞型，而 Mes-1、肝星狀細胞和各種內皮細胞群的混合物為少數亞型（圖2G）。此外，進一步探究發現基質細胞限制巨噬細胞的成熟是依賴于細胞間之間接觸機制的（圖2H）。

圖2肝纖維化細胞限制巨噬細胞成熟

5、基質細胞限制巨噬細胞向CD9⁺ SAMs的分化

由于CD9+ SAMs亞群在硬化肝臟中增加而CD163+ KC亞群減少，所以作者探究了是否基質細胞改變了髓系細胞分化為巨噬細胞亞群的臨床相關性。RNA-seq分析顯示，CD14+細胞單獨培養與SAMs相似，而CD14+細胞與基質細胞共培養在轉錄上與KCs相似（圖3B）。基因表達分析證實了這種相關性，CD14+單獨培養CD9，FABP5，TREM2的表達增加，類似SAMs亞群，但是和基質細胞共培養則CD163，C1QA，CTSB的表達增加，類似KC亞群（圖3C）。因此，作者猜想CD9+和CD163+可能分別是SAMs亞群和KC亞群的標記。為檢驗該猜想，進行了流式定量分析，CD14+細胞與基質細胞共培養減少了CD9+的比率并增加了CD163+的比率（圖3D）。這些數據驗證了作者的猜想，即基質細胞信號調控巨噬細胞分化可能通過限制SAM保護干燥免受纖維化。

圖3肝纖維化細胞減少CD9⁺ SAMs的分化

6、基質可溶性因子足以限制SAM的分化且依賴于IL-6/IL-6R通路

鑒于基質接觸是巨噬細胞成熟所必須的，作者評估了這種接觸是否也是巨噬細胞分化所必須的。結果發現上清液轉移和共培養的方法都能誘導KC樣CD163+和限制SAM樣CD9+表達，提示基質可溶性因子足以控制巨噬細胞分化（圖4A）。

隨后使用RNA-seq對體外基質細胞和CD14 +細胞進行了注釋的同源受體-配體對表達分析，以檢測控制巨噬細胞分化的潛在機制。識別到可溶性和依賴于接觸的注釋通路，但重點關注可溶性通路，因為它們足以改變分化（圖4B）。作者驗證了一系列基質-髓對，包括IL-6/IL-6R（圖4C）。與CD14+細胞單獨培養組比較，IL-6蛋白表達在共培養組顯著升高（圖4D），提示其可能參與兩者的相互作用。RNA-seq證實了IL-6在肝臟基質細胞中的表達和IL-6R在CD14+細胞的表達（圖4E）。這些數據說明基質可溶性因子對SAM分化的限制依賴于IL-6/IL-6R通路。

圖4基質可溶性因子足以限制SAM的分化和IL-6/IL-6R通路上調

7、基質細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9⁺ SAMs的分化

為了進一步探究是否是IL-6影響了巨噬細胞亞群分化，使用IL-6R抗體阻斷了IL-6信號通路，結果發現IL-6R抗體處理顯著降低了共培養體系和上清液體系中的CD163+ KC樣亞群，而增加了CD9+ SAM樣細胞亞群，表明CD+向CD163+分化受到限制（圖5A-B）。隨后作者探究通過IL-6/IL-6R復合物能否控制巨噬細胞分化。經典的IL-6信號涉及IL-6與膜結合的IL-6R和gp130蛋白的相互作用，而反式IL-6信號允許IL-6與可溶性IL-6R復合體，并與細胞膜上的gp130蛋白相互作用。所以作者檢測了CD14+細胞單獨培養72小時后，重組IL-6 （rIL-6）（經典），或IL-6/IL-6R融合（FC-IL-6）（反式）蛋白CD9+和CD163+的表達，（圖5C）。這些結果表明經典和反式IL-6都能調節巨噬細胞分化。DWLSf分析證實rIL-6處理的CD14+細胞轉錄最大程度上接近于KC肝細胞亞群，類似于基質共培養細胞（圖5D）。此外，圖5E-F的結果提示IL-6起源于肝臟基質細胞亞群并分布于整個肝臟組織，并且基質IL-6主要產生于Mes2細胞。臨床樣本證實，和健康對照的肝臟組織比較，IL-6的表達在NSAH和SS肝組織中顯著下降（圖5G）。這些結果表明基質細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9+ SAMs的分化，并且認為干預IL-6通路可調節巨噬細胞分化。

圖5基質細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9⁺ SAMs的分化

參考文獻：

Buonomo Erica L., Mei Shenglin., Guinn Samantha R., Leo Isabelle R., Peluso Michael J., Nolan Mei-An., Schildberg Frank A., Zhao Lei., Lian Christine., Xu Shuyun., Misdraji Joseph., Kharchenko Peter V., Sharpe Arlene H.(2022). Liver stromal cells restrict macrophage maturation and stromal IL-6 limits the differentiation of cirrhosis-linked macrophages. J Hepatol, 76(5), 1127-1137. doi:10.1016/j.jhep.2021.12.036