高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）的異質性沒有得到很好的研究，這嚴重阻礙了HGSOC的臨床治療。因此，有必要描述HGSOC在其腫瘤微環境（TME）中的異質性。我們通過深度單細胞RNA測序(scRNA-seq)對早期或晚期HGSOC患者和非惡性卵巢樣本進行分析。我們利用scRNA-seq對從HGSOC和非惡性卵巢組織中獲得的59324個單細胞進行了測序。在這些細胞中，腫瘤細胞具有上皮-間充質轉化（EMT）相關基因特征，其中NOTCH1、SNAI2、TGFBR1和WNT11的組合被進一步選擇為預測HGSOC患者不良預后的基因。基質癌相關的成纖維細胞（mCAF）是HGSOC腫瘤中的優勢CAF，在共培養系統中可以誘導卵巢癌細胞的EMT特性。特異性免疫細胞亞群，如C7-APOBEC3A M1巨噬細胞、CD8+TRM、TEX細胞，在早期腫瘤中優先富集。此外，免疫共抑制受體TIGIT 阻斷可顯著減少小鼠卵巢癌模型中的腫瘤生長。我們的研究結果主要應用于預測HGSOC患者預后的四種EMT基因模型、mCAFs增強卵巢癌細胞侵襲的能力以及抗TIGIT治療的潛在治療價值。本文于2022年6月發表在“Clinical Cancer Research”（IF=13.801）上。

技術路線

結果：

1）非惡性卵巢和原發性HGSOC腫瘤生態系統的單細胞分析

為了系統地研究HGSOC的腫瘤內異質性，我們對12例初治患者的單個卵巢細胞進行了深度scRNA-seq檢測，其中包括7例HGSOC患者和5例年齡匹配的非惡性卵巢患者。按照標準程序，從這些樣本中總共獲得59324個細胞。其中，33264個細胞（56%）來自HGSOC腫瘤，26060個（44%）來自非惡性卵巢（圖1A）。然后對這些細胞進行聚類，并根據建立的基因標記列表進行注釋。使用UMAP方法對細胞進行可視化，如圖1B所示。此外，圖1C顯示了生態系統細胞類型的識別，包括T細胞譜系、上皮細胞、單核細胞、內皮細胞類型、細胞周期細胞、成纖維細胞、B細胞和漿細胞類型以及平滑肌細胞/肌成纖維細胞。然后應用KEGG分析來揭示每個細胞子集的特征（圖1D）。對于HGSOC腫瘤的上皮細胞，分析顯示與鐵死亡相關的基因富集。對于那些在非惡性卵巢組織中，我們的工作顯示了卵巢類固醇生成的基因富集。接下來，我們將細胞簇與腫瘤特征相關聯。隨著腫瘤分期的延長，T細胞簇的比例降低（圖1E）。

2）不同腫瘤階段的生態系統上皮細胞特征

我們分析了腫瘤上皮細胞的特征。在所有組織中共收集14636個卵巢上皮細胞，并將其分為12個簇，包括8192個來自HGSOC腫瘤的細胞和6444個來自非惡性卵巢組織的細胞（圖2A和B）。然后應用CytoTRACE預測這些上皮細胞的分化狀態，并識別HGSOC中的靜止干細胞（圖2C）。為了更好地理解上皮細胞在腫瘤發展中的作用，將Monocle算法應用于惡性上皮細胞的擬時分析，以預測其發展軌跡。根據基因表達相似性聚集了11個細胞簇，并將其投射到一個擬時過程中，該過程被定義為HGSOC基本期、2期和3期腫瘤（圖2D）。沿著軌跡，第3階段簇1細胞的基因特征被描述為某些功能途徑，包括focal adhesion、雌激素信號通路、PI3K-AKT信號通路、relaxin信號通路、凋亡和rap1信號通路（圖2E）。為了檢查EMT標記物與患者生存率的相關性，使用TCGA和GEO在線分析和可用的OS結果評估了TCGA HGSOC數據集、GEO HGSOC數據集和兩個漿液性卵巢癌數據集。我們的分析表明，四個基因，包括NOTCH1、SNAI2、WNT11和TGFBR1在這四個批量表達數據集中的至少三個隊列中與不良預后顯著相關。值得注意的是，在所有這四個數據集中，這四個基因的組合與較差的OS相關（圖2F）。此外，通過免疫熒光分析進一步驗證了HGSOC組織中的其他EMT標記基因CDH1和VIM，結果表明，一組強大的細胞具有潛在的EMT功能（圖2G）。

3）基質間充質干細胞的多樣性和CAFs的特征

我們繼續研究基質成纖維細胞的特征。在13201個成纖維細胞中，出現了14個細胞簇（圖3A）。在許多非惡性卵巢特異性成纖維細胞中觀察到間充質干細胞（MSC）的特性（圖3A）。根據每個基因表達特征，將非惡性成纖維細胞分成三個亞群。MSC亞群1、2和3分別稱為NT5E/THY1/ENG+MSCs、NT5E/ENG+MSC樣細胞和ENG+MSC樣細胞（圖3A和B）。在惡性成纖維細胞中，具有強烈細胞外基質特征的mCAFs，如PTHLH、FGF1、WNT7B、WNT2和TGFB3，是HGSOC腫瘤中的主要CAFs（圖3C）。除此之外，主要來自癌癥患者6的mCAFs表現出顯著高水平的MMP11、THRC1、POSTN、VCAN和COL10A1（圖3D）。一致地，通過使用TCGA HGSOC數據進行生存分析，圖3E一致顯示了這些頂級標記基因的高表達與患者預后差之間的相關性。IF染色表明，晚期HGSOC的mCAFs對典型CAF標記a-SMA、波形蛋白和COL3A以及mCAF標記COL10A和MMP11呈陽性（圖3F）。這些mCAFs具有一定的促EMT特性，表現為在CAF/卵巢癌細胞(A2780或OVCAR3) transwell共培養體系中，間充質生物標記物如ZEB1、波形蛋白和snail在蛋白質水平上的上調，腫瘤細胞侵襲能力的增加(圖3G和H)。

4）M1巨噬細胞的富集表明HGSOC早期預后良好

我們通過MNN聚類方法將巨噬細胞簇重新排列為10個簇，以深入分析細胞特征（圖4A）。進一步將這些簇的基因表達模式與M1、髓源性抑制細胞（MDSC）和M2巨噬細胞的經典表達模式進行比較（圖4B）。我們的結果表明，C7-APOBEC3A細胞簇高度表達M1巨噬細胞相關基因，包括IFI6、ISG20、LY6E、IFIT3、CXCL10和IL1RN（圖4B）。簇C0-OLFML3細胞具有所有三種巨噬細胞亞型特征，表明HGSOC腫瘤TME中M1、MDSC和M2巨噬細胞之間的動態轉化（圖4B）。然后在HGSOC組織中檢測巨噬細胞與其他免疫細胞類型的相互作用能力。單核細胞、B細胞、T細胞和自然殺傷細胞的遷移程度在腫瘤晚期減弱，表明巨噬細胞失去了對其他免疫細胞的吸引力（圖4C）。相反，許多代表巨噬細胞中生長因子分泌的基因在腫瘤晚期顯著誘導（圖4C）。簇C7-APOBEC3A細胞已顯示M1巨噬細胞具有抗腫瘤活性（圖4D）。圖4E顯示C7-APOBEC3A簇顯示趨化因子的分泌增強，包括CCL8、CXCL10、CXCL11和TNFSF10。在C7-APOBEC3A巨噬細胞中觀察到SAA1、APP、ANXA1和FPR2的誘導，這代表了巨噬細胞的激活(圖4F)。C7-APOBEC3A簇的基因標記與較好的預后相關（圖4G），而聚類C1-TCOF1與不良預后相關（圖4H）。

5）CD8+T細胞在HGSOC和非惡性卵巢組織中的分類和功能注釋

與非惡性組織相比，除了巨噬細胞外，HGSOC腫瘤中淋巴細胞的特征和分布也得到了表征。HGSOC和非惡性卵巢組織中存在浸潤性淋巴細胞，通過IHC和IF證實（圖5A）。由于T細胞系攜帶CD8A基因富集（圖1C），我們通過CD8A抗體的IF分析證實了其在HGSOC腫瘤中的存在（圖5B）。通過MNN聚類方法將CD8A+T細胞重組為九個簇（圖5C），它們分布在不同的組織中（圖5C）。例如，以CD8-C1-IFIT3為代表的組織駐留記憶CD8+T細胞（CD8+TRM細胞）更局限于腫瘤組織中。以CD8-C5-DNAJB1基因模式為特征的中央記憶CD8+T細胞（CD8+TCM細胞）主要來自非惡性卵巢細胞（圖5C）。值得注意的是，耗竭T細胞（CD8+TEX細胞），以CD8-C0-CXCL13或CD8-C7TNFRSF4為標記，由腫瘤細胞填充。接下來，我們關注了在HGSOC組織中富集的兩種細胞類型，包括CD8+TRM和CD8+TEX細胞。為了更好地了解CD8+TEX細胞在HGSOC中的作用，深入探討了CD8+TEX細胞的基因表達模式。在這些標記中，CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、SIRPA和TIGIT是排名靠前的基因（圖5D）。值得注意的是，共抑制受體TIGIT在HGSOC組織中高水平表達。圖5E顯示，CD8+TEX細胞的數量在第一階段早期較高，但在晚期減少。有趣的是，PAGA擬時分析表明，耗盡T細胞（CD8+TEX細胞）的優先富集，也稱為CD8+TRM CXCL13細胞，位于CD8+TRM和TEM細胞分化的末端（圖5F）。

CD8⁺T_RM細胞有助于早期HGSOC腫瘤的局部免疫保護。為了解釋早期HGSOC腫瘤中CD8⁺T_RM細胞是如何形成的，我們檢查了生存因子的表達，如IL15、IL17和NOTCH配體，其中，IL15在HGSOC來源的惡性上皮細胞中表達，并誘導CD8⁺T_RM細胞和CD8⁺T_EX細胞的形成（圖5G）。除上皮細胞外，HGSOC腫瘤中的M1巨噬細胞主要表達CXCL9和CXCL10，通過CXCL9/CXCL10-CXCR3相互作用招募CD8⁺T_RM細胞（圖5G）。我們還檢測了CD8⁺T_RM細胞的基因特征與患者生存率的相關性，并證明CD8⁺T_RM細胞的特征與改善患者生存率顯著相關（圖5H）。總的來說，我們的發現有力地表明了早期HGSOC腫瘤中CD8⁺T_RM/T_EX細胞和上皮細胞以及巨噬細胞之間的潛在相互作用機制。

6）TIGIT阻斷劑在卵巢癌發生中的作用

已知免疫共抑制受體TIGIT可調節抗腫瘤CD8⁺T細胞反應，在我們的研究中，其也在CD8⁺T_EX細胞上高表達。接下來，我們測試了TIGIT阻斷是否有助于卵巢癌的生長，將ID8細胞皮下注射到8只雌性C57BL/6小鼠體內。8周后，用抗TIGIT或同型匹配的對照抗體治療ID8荷瘤小鼠（圖6A）。正如預期的那樣，抗TIGIT治療的小鼠顯示出減少的腫瘤負擔（圖6B），如腫瘤生長遲緩（圖6C）、終點處較低的腫瘤體積和腫瘤重量（圖6D和E）。TIGIT阻斷顯著抑制腫瘤中TIGIT⁺-CD8⁺T細胞的頻率（圖6F和G）。這些結果表明，抗TIGIT抗體對CD8⁺T細胞的TIGIT中和減輕了ID8荷瘤小鼠的腫瘤負擔。

結論：我們詳細描述了早期和晚期原發性HGSOC腫瘤的全面單細胞轉錄組圖譜。利用擬時分析描述不同腫瘤分期的上皮細胞發育層次，并鑒定EMT的特性。此外，免疫共抑制受體TIGTI阻斷劑可抑制ID8來源的C57BL/6小鼠模型的腫瘤生長。我們的研究報告了HGSOC獨特的TME特性以及與腫瘤分期相關的腫瘤細胞特征，這將有助于開發新的治療HGSOC的臨床策略。

參考文獻：

Xu J, Fang Y, Chen K, Li S, Tang S, Ren Y, Cen Y, Fei W, Zhang B, Shen Y, Lu W. Single-cell RNA sequencing reveals the tissue architecture in human high-grade serous ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2022 Jun 8:clincanres.0296.2022-1-28 03:44:54.997. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-0296.