炎性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一組可誘發結腸和小腸長期炎癥的疾病，包括潰瘍性結腸炎、克羅恩病等，這些疾病可能進一步誘發更嚴重、更致命的疾病，如結直腸癌。已有研究報道，IBD的病因和發病機制與腸道黏膜屏障功能受損和腸道微生態失調有關。然而IBD的臨床醫學干預不能解決炎癥性腸病的根本原因，很多藥物容易引起嚴重的不良反應。本研究旨在解決炎癥性腸病的根本原因，并降低副作用。本文與2022年6月發表于《Nature Communication》,IF=12.121

本文技術路線

本文主要內容：

1.      工程益生菌治療炎癥性腸病

已有研究表明，殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN- pe[ECN-pE(C/A)2]可以調節腸道菌群，提高腸道菌群豐富度(OTU)和多樣性(Shannon多樣性指數)緩解腸道炎癥。對ECN進行基因改造，使其產生能有效清除活性氧的CAT和SOD（Fig 1A）。ECN-pE(C/A)2灌胃小鼠，殼聚糖/海藻酸鈉包裹可顯著提高其胃腸道內生物利用度（Fig 1B）。ECN-pE(C/A)2通過消除對炎癥性腸病有顯著的姑息作用，并調節腸道菌群（Fig 1C）。     

Fig1 工程益生菌治療炎癥性腸病。

2.殼聚糖/海藻酸鈉包裹的益生菌對胃腸道具有保護作用

ECN是一種著名的益生菌，考慮到其在臨床中安全使用的悠久歷史，作者選擇了ECN，由于其與當前基因操作技術的兼容性，成為工程表達不同蛋白質的最佳選擇。為了使增加ECN的ROS清除能力，作者利用含有CAT和SOD基因的pET28a-T5載體，通過誘導劑異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)轉化ECN，形成CAT和SOD穩定表達的ECN (ECN- pe)。成功構建表達CAT、SOD的ECN。

如圖2a所示，陽離子殼聚糖成功包覆ECN-pE(ECN-pE(C))，zeta電位由37.3 mV上升到5.9 mV，而陰離子海藻酸鈉有效包覆ECN-pE(C/A)的zeta電位下降到36 mV。進一步加入殼聚糖后，ECN-pE(C/A)1.5的zeta電位再次變為4.4 mV。經海藻酸鈉進一步包覆后，ECN-pE(C/A)2再次呈現負的zeta電位(38.1 mV)。為了進一步證明殼聚糖和海藻酸鈉的成功涂層，作者使用了熒光標記殼聚糖和海藻酸鈉，熒光強度也隨著層數的增加而增加，證實了殼聚糖和海藻酸鈉在ECN-pE上的成功涂層(Fig. 2b)。接下來，研究了不同層殼聚糖/海藻酸鈉對ECN-pE的活力(Fig. 2c)。經1 ~ 2層殼聚糖/海藻酸鈉包裹后，ECN-pE仍保持良好的細胞活性，僅比未包裹的ECN-pE略有降低。但三層包裹明顯降低了細菌的活力，說明三層包裹可能損害了細菌的代謝活性。因此，本實驗采用雙層殼聚糖/海藻酸鈉涂層(ECN-pE(C/ a)2)進行實驗。此外，殼聚糖/海藻酸鈉涂層對CAT和SOD的表達也沒有影響（Fig 2d）。之后，檢測了ECN(C/A)2, ECN(C/A)2+IPTG, ECN-pE(C/A)2, 以及ECN-pE(C/A)2 + IPTG的SOD能力。ECN-pE(C/A)2在IPTG作用下表現出較高的SOD活性，O2?清除率達94%，進一步證實ECN-pE(C/A)2在IPTG孵育下能正確生成重組SOD。ECN-pE和ECN-pE(C/A)2在IPTG作用下表現出相似的濃度依賴性SOD催化活性(Fig. 2f)。此外，ECN-pE和ECN-pE(C/A)2在IPTG培養下也表現出類似的過氧化氫分解能力，且呈濃度依賴性，表明重組CAT的合成成功（Fig. 2g, h）。

由圖2I, j可以看出殼聚糖/海藻酸鈉包裹益生菌對胃腸道的保護作用，在SGF或4%膽鹽孵育2 h后，ECN-pE(C/A)2的形態完全沒有損傷，而未包裹的ECN-pE則出現了細菌細胞壁的損傷，這表明雙層殼聚糖/海藻酸鈉包裹對益生菌具有良好的保護作用胃腸道環境。為了進一步驗證其作用機制，首先將ECN-pE和ECN-pE(C/A)2置于SGF溶液中孵育。如圖2k所示，ECN-pE暴露于SGF后2 h內迅速死亡，而雙層殼聚糖/海藻酸鈉涂層(ECN-pE(C/ a)2)的CFU每毫升僅下降10倍，進一步說明了兩層殼聚糖/海藻酸鈉涂層對胃腸道環境中益生菌的保護作用。如圖2l-n所示，來自 ECN-lux(C/A)2的生物發光信號較ECN-lux高5倍， 表明ECN在胃腸道的生存率 經殼聚糖/海藻酸鈉包裹后，腸道結構得到了較大的改善。值得注意的是，與未包裹ECN-pE相比，給藥1小時后胃中存活ECN-pE(C/A)2的數量幾乎高出4倍(Fig. 2o)。更有趣的是，口服ECN-pE后，腸、結腸和盲腸內存活ECN-pE(C/A)2的數量也明顯高于未包裹的(Fig. 2p–r)。

Fig2殼聚糖/海藻酸鈉包裹的益生菌對胃腸道的保護作用

3. 殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE可以有效緩解dss誘導的急性IBD

急性IBD C57BL/6小鼠分別用PBS、ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2或ECN- pe治療，在此過程中，所有IBD小鼠都飲用含有IPTG (1 mM)的飲用水，誘導CAT和SOD的持續表達(Fig. 3a)。與對照組(PBS + 3% DSS)相比，ECN-pE(C/A)2處理對DSS誘導的IBD有明顯的保護作用，包括體重減輕、結腸長度縮短和結腸組織損傷。相比之下，ECN-pE不能完全緩解小鼠體重減輕和DAI升高，因為ECN-pE在沒有殼聚糖/海藻酸鈉包裹的情況下生物利用度較低(Fig. 3b–h)。此外，ECN(C/A)2處理的小鼠由于缺乏CAT和SOD的表達，也表現出明顯的體重下降和結腸長度縮短(Fig. 3b, e)。CN-pE(C/A)2處理的小鼠結腸組織病理學評分較低，與對照組(PBS+水)接近，上皮完整，指狀隱泡結構規則，炎癥細胞比例較低，表明ECN-pE(C/A)2能顯著促進結腸組織的修復。ECN(C/A)2處理的小鼠結腸組織病理組織學評分較高，與DSS處理組(PBS + 3% DSS)接近，隱窩變形完全，杯狀細胞嚴重丟失，炎癥細胞浸潤明顯（Fig. 3g, h）。由于缺乏殼聚糖/海藻酸鈉涂層保護，ECN-pE只能部分緩解小鼠結腸組織損傷。此外，ECNpE小鼠結腸中ibd相關的MPO活性(C/A)2處理也顯著下降，表明ECN-pE(C/A)2能有效緩解氧化應激，緩解IBD (Fig. 3i)。采用ELISA法檢測典型促炎細胞因子白細胞介素-1β (IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-6 (IL-6)的水平。如圖3j-l所示，IL-1β、DSS處理小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6顯著上調。抗炎細胞因子，如白細胞介素-10 (IL-10)和轉化生長因子-β (TGF-β)的水平相應上調， 進一步證明ECN-pE(C/A)2(Fig 3m, n)具有良好的抗炎作用。綜上所述，殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE表達CAT和SOD，可以有效緩解dss誘導的急性IBD。

Fig 3殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE可以有效緩解dss誘導的急性IBD

4. ECN-pE(C/A)2對不同小鼠IBD模型均表現出良好的治療效果。

然后，作者研究了ECN-pE(C/A)2對結腸上皮細胞和受損的結腸上皮屏障的影響，這是dss誘導的急性IBD32的關鍵特征。根據免疫熒光染色結果(Fig. 4a, b, d, e)。與ECN-pE相比，ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2處理均能有效上調結腸組織中ZO-1和Occludin的表達，進一步說明抗氧化酶(CAT和SOD) 和殼聚糖/海藻酸鈉涂層在結腸上皮修復中的作用的關鍵作用。此外，FITC -右旋糖酐灌注試驗也用于評估結腸通透性。與dss處理的小鼠相比，ECN-pE(C/A)2處理的小鼠血清中fitc -右旋糖酐信號明顯降低，表明DSS誘導結腸炎小鼠中腸屏障修復(Fig. 3f)。ECN-pE(C/A)2處理顯著緩解結腸上皮細胞凋亡水平，與健康小鼠的凋亡水平非常接近(Fig 4C.4F)。為了評估其安全性，作者進行了多項指標的檢測，發現ECN-pE(C/A)2處理各項指標與健康小鼠無明顯差別(Fig. 4g)。

Fig 4 ECN-pE(C/A)2對不同小鼠IBD模型均表現出良好的治療效果

5. ECN-pE(C/A)2對腸道菌群的調節作用

作者研究了ECN-pE(C/A)2對抗生素預處理的dsd小鼠急性IBD的治療效果。經抗生素預處理后ECN-pE(C/A)2的治療效果明顯降低，提示腸道菌群可能在急性IBD的調節中發揮重要作用(Fig. 5a-g)。因此，作者進一步研究了ECN-pE(C/A)2是否可以調節dss誘導的小鼠IBD模型中腸道菌群的豐度。然后，通過16S rRNA基因測序分析腸道菌群豐度，結果表明口服ECN-pE(C/A)2能顯著改變dss處理小鼠腸道菌群豐度和多樣性(Fig. 5h, i)。此外， ECN-pE(C/A)2處理之后，健康組和DSS處理組小鼠 Escherichiashigella (一個能促進炎癥性腸病致命的病原體) 的相對豐度降低(Fig. 5j–n)。

Fig 5 ECN-pE(C/A)2在IBD治療期間調節腸道菌群

6. ECN-pE(C/A)2對IBD具有緩解作用

為了進一步探討ECN-pE(C/A)2對IBD延遲治療的療效，作者研究ECN-pE(C/A)2對IBD延遲治療的療效。建立C57BL/6小鼠急性IBD之后，在第5、6、7、9天進行ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2或ECN- pe小鼠灌喂(Fig. 6a)。值得注意的是，ECN-pE(C/A)2治療有效地保護小鼠免受dss誘導的急性IBD，包括結腸長度縮短、體重減輕、結腸上皮組織損傷和MPO活性增加 (Fig. 6b–g)。此外，ECN-pE(C/A)2處理還能抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的水平，并且上調抗炎細胞因子水平(Fig. 6h–l)。這些結果驗證了ECN-pE(C/A)2對dss誘導的急性IBD具有明顯的延緩緩解作用。

Fig 6 ECN-pE(C/A)2對IBD具有緩解作用

本研究表明，在小鼠模型中口服具有生物膜自我涂層的基因工程益生菌可以有效地調節炎癥和腸道菌群，緩解急性結腸炎。鑒于腸道菌群失調和腸道炎癥與許多其他系統性疾病高度相關，益生菌基因工程結合功能性表面涂層可能為許多其他疾病的治療提供方便和有益的平臺。

參考文獻：

Zhou, J., et al., Programmable probiotics modulate inflammation and gut microbiota for inflammatory bowel disease treatment after effective oral delivery. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 3432.